乳酸菌亞硝酸還原酶代謝調控研究進展

周 通，徐 波

(江西農業大學生物科學與工程學院，江西 南昌330045)

1 亞硝酸鹽污染是發酵食品生產中亟待解決的關鍵問題

我國蔬菜深加工產品-醬腌菜生產歷史悠久，品種繁多。食用醬腌菜，可攝入益生菌-乳酸菌及其代謝產生的有機酸等，促進胃腸蠕動，防止便秘，刺激腸道免疫細胞產生抗體，抑制腸道腐敗細菌生長，減弱腐敗菌在腸道產毒，防止細胞老化，降低膽固醇，調節人體生理功能等保健和醫療作用。

但是蔬菜在腌制和貯藏過程中極易產生亞硝酸鹽污染。由于亞硝酸鹽可與食品中蛋白質分解產物次級胺(仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸)結合，生成強致癌的N-亞硝基化合物，長期攝入亞硝酸鹽有致突變和致癌的危險，可誘發肝癌、食管癌、胃癌等多種癌癥和疾病。隨著人們食品安全意識的提高，發酵食品中亞硝酸鹽污染的安全問題也日益受到人們的關注，如何降解亞硝酸鹽類物質是發酵食品生產中亟待解決的關鍵問題［1］。

2 利用食品級亞硝酸鹽還原酶降解發酵食品中產生的亞硝酸鹽，是應對亞硝酸鹽污染的根本對策，對保障我國食品安全具有重要意義

目前，國內外對蔬菜加工中亞硝酸鹽的研究主要集中在蔬菜發酵過程中亞硝酸鹽變化規律，而對亞硝酸鹽的降解機理研究，以及影響亞硝酸鹽的微生物菌系及其相關酶系等則研究甚少。利用微生物降解亞硝酸鹽是當前的研究重點和熱點。微生物降解亞硝酸鹽主要是利用亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase，Nir)降低亞硝酸鹽含量［2］，尤其是利用食品級安全菌株-乳酸菌產生的亞硝酸鹽還原酶徹底降解亞硝酸鹽是應對亞硝酸鹽污染的根本對策，對保障我國食品安全具有重要意義［3］。

3 乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的分子調控機制尚不明晰

從生物脫氮理論分析亞硝酸鹽降解有羥胺途徑還原成氨氣和還原成氮氣2個途徑。一些兼性厭氧細菌能利用硝酸氮為營養，在硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的作用下將硝酸鹽還原為氨，進而生物合成氨基酸、蛋白質和其它含氮有機物。

迄今為止，人們共發現了4種類型Nir，其中nirK編碼的可溶性含銅酶和nirS編碼的細胞色素cd1還原酶被廣泛研究。這2種酶在限氧和厭氧條件下以N代替O2作為電子受體構成氧化呼吸鏈，使N接受電子被還原為NO，它們雖然在結構上有差異，但功能和生理上無差異［4，5］。nrfA編碼的細胞色素C亞硝酸鹽還原酶和nasB編碼的亞硝酸鹽同化還原酶催化N還原為N，其主要差別是前者將N排放到細胞外，后者利用N合成氨基酸［6］。

NirS分子量約為120KDa，由2個相同的亞單位組成，每單位含一個e型和d1型血紅素，脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)Nir晶體結構的研究表明:c亞鐵血紅素是電子進入位點，而d1是底物結合和催化的活性中心［7］。NirK為三聚體，每個亞單位有2個銅原子，分子量為36KDa，2個銅原子組成Ⅰ型(藍色)銅活性中心和Ⅱ型(非藍色)銅活性中心。Ⅰ型與亞單位內的基團結合，Ⅱ型與三聚體中2個亞單位的基團結合，Ⅰ型被認為是電子由供體流向Nir的入口，Ⅱ型則被認為是催化中心，亞硝酸鹽結合在Ⅱ型上［8］。

在銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、Pa.denitrificans和斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)中，nir和一氧化氮還原酶(Nor)的結構基因(nor)在染色體上相距10 kb，是一對連鎖基因［9，10］，并且nir與相關基因也常常發生連鎖。在P.aeruginosa中，11個nir相鄰基因表達產物都與Nir活性有關［11］，有些基因以同一方向轉錄至一條mRNA中［12］。然而，在P.stutzeri細胞內，有些基因被重新排列，相關基因不再相鄰，且轉錄至3條或3條以上mRNA中［13］。

目前對Nir的生化和分子機理研究主要集中在反硝化固氮菌如P.stutzeri和Pa.denitrificans的研究，而對乳酸菌的nir操縱子(nir operon)和轉錄調控蛋白結構、功能及調控機制的研究鮮有報道，其分子調控機制尚不清楚。

4 研究乳酸菌氮代謝全局性轉錄調控蛋白GlnR對Nir的調控機制，不僅是揭示亞硝酸鹽降解的分子調控機制的首要研究內容，也是加快消除發酵食品、飼料中亞硝酸殘留等問題的必要基礎

革蘭氏陽性細菌已進化出復雜、多樣的氮代謝調控機制，而氮代謝全局性轉錄調控蛋白GlnR廣泛存在于革蘭氏陽性細菌中，對很多參與氮代謝的基因都有調控作用。氮代謝途徑的相關基因中，glnA、gdhA、glnPQ、amtB、nirBD、ureA、glnK、glnD等均受GlnR的調控［12，14］。目前發現的GlnR既有MerR家族也有OmpR家族，針對可利用氮源的變化，GlnR可以抑制或激活氮代謝相關基因的表達。因此，研究GlnR介導的代謝調控有助于深入了解細菌中心氮代謝，對研究氮代謝調控中的信號傳導等具有重要的意義。

最近，通過生物信息學手段搜尋與GlnR結合序列的啟動子，結合體外實驗，在天藍鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)中發現10個GlnR靶標，這些基因主要有負責氮的吸收和調節的操縱子(amtB-glnK-glnD)，亞硝酸鹽和硝酸鹽的降解基因(nirB和nasA)，脲酶基因(ureA)以及谷氨酸和谷氨酰胺合成基因(glnA，glnII和gdhA)，GlnR主要對其靶基因起激活或抑制作用。在氮源限制時，GlnR可以激活glnA，glnII，amtB和nirB的表達，并抑制gdhA(編碼GDH)和ureA(編碼尿酶)的轉錄［15，16］。Rafat等人發現S.coelicolor的一個GlnR新的靶基因-nnaR(硝酸鹽和亞硝酸鹽降解調控子)編碼一個轉錄調控蛋白，其N端為推定的類-HemD酶區域，C端為DNA結合域，NnaR不是酶激活蛋白但作為GlnR共激活因子調控硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶基因的轉錄［17］。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為最典型的低G+C含量革蘭氏陽性菌模式菌株，其氮代謝轉錄調控機制已有詳盡的報道［18］。2個MerR家族的調控蛋白GlnR和TnrA，以及全局調控蛋白CodY相互協調控制氮代謝相關基因的表達，以保證枯草芽孢桿菌在不同氮源條件下獲得充足的氮源。GlnR和TnrA通過感應谷氨酰胺的濃度來實施調控，它們識別相同的操作子序列(TnrA/ GlnR識別位點，5-T6TNA-7NTNACAT-3)。GlnR可以抑制其所在操縱子glnRA以及脲酶操縱子ureABC，甚至tnrA基因的表達，而TnrA可以激活或抑制氮代謝相關基因的表達。TnrA只有在氮源受限時被激活，而 GlnR在氮源過量時被激活［19～21］。通過BLASTP程序比對NCBI的乳酸桿菌基因組，結果發現幾乎所有的乳酸桿菌中均無TnrA的同源物，只有GlnR調控蛋白，并且乳酸桿菌存在多種氨基酸營養缺陷型。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis MG1363)是乳酸菌的模式菌株，Rasmus Larsen［22］等通過構建乳酸乳球菌glnR缺失突變株結合DNA微陣列方法發現了10個GlnR靶標，其中包括直接靶標gln-RA操縱子(銨轉運及感應操縱子amtB-glnK和谷氨酰胺/谷氨酸ABC轉運蛋白編碼基因glnPQ)。乳酸乳球菌glnR缺失突變株中glnA、amtB-glnK操縱子的表達被高度抑制，amtB-glnK啟動子-35區上游的GlnR盒對GlnR介導的抑制作用極為重要。

GlnR不僅參與細菌的氮代謝調控，同時也與細菌的多種代謝途徑存在交叉調控。隨著研究不斷深入，越來越多氮代謝相關基因被發現受GlnR的調控，GlnR的調控作用甚至與細菌毒性、次級代謝、磷酸鹽同化等方面均有關［23］。但是GlnR對這些靶標基因的間接調控作用有待于進一步的研究。深入研究GlnR在其它代謝途徑中的作用，對進一步闡述GlnR參與次級代謝活性產物、細菌形態分化、細菌毒性等的調控具有重要的意義。

5 研究乳酸菌亞硝酸還原酶代謝調控意義

隨著更多細菌基因組測序的完成，結合強有力的生物信息學預測手段，以及高通量技術的應用，如蛋白質組技術、DNA芯片技術等，為理清全局調控網絡之間的復雜關系提供了有效手段，越來越多的GlnR靶標被發現，其中不乏間接靶標，但是GlnR對這些靶標基因的間接調控作用有待于進一步的研究。雖然幾個菌屬中GlnR的調控模式已經研究得很詳細，但調控GlnR活性的信號和機制目前還不是很清楚，亟須更深入的研究。可見，構建乳酸菌氮代謝的基因轉錄網絡、明確基因轉錄的相互調控關系和關鍵調控基因已具備了必須的技術條件;基因轉錄的相互調控關系和關鍵調控基因的明確不僅是揭示亞硝酸鹽降解的分子調控機制的首要研究內容，也是加快消除發酵食品、飼料中亞硝酸殘留等問題必要基礎。

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