吡格列酮對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟氧化應激的影響

吳青紅　阮水良

吡格列酮對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟氧化應激的影響

吳青紅阮水良

【摘要 】目的觀察吡格列酮對高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠肝臟組織氧化應激的影響。 方法將30只SD大鼠隨機分為正常組、模型組和吡格列酮組（每組10只）。正常組全程飼以普通飼料，另兩組均給予高脂飲食。6周后每組各處死2只大鼠，驗證NAFLD造模成功后，給予吡格列酮組大鼠10mg·kg-1·d-1吡格列酮灌胃，正常組、模型組給予相應體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。6周后處死并留取肝組織，行病理組織學檢查，硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）的含量，免疫組織化學法檢測肝臟組織血紅蛋白氧合酶（HO）-1的表達。 結果與模型組相比，吡格列酮組大鼠肝組織病變改善，MDA的含量顯著下降，且該組肝臟組織內HO-1表達較正常組、模型組均顯著升高（均P＜0.05）。 結論吡格列酮可誘導NAFLD大鼠肝臟組織內HO-1的表達，減弱氧化應激，可能是其改善NAFLD病理變化的機制之一。

【關鍵詞 】吡格列酮非酒精性脂肪性肝病大鼠氧應激血紅蛋白氧合酶

【 Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of pioglitazone on oxidative stress in rats with high fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).MethodsThirty SD rats were randomly divided into normal group,model group and pioglitazone group(n=10 in each).NAFLS was induced by feeding of high-fat diet in rats of model and pioglitazone groups.Rats in pioglitazone group were gavaged with 10mg/kg of pioglitazone daily;rats in normal and model groups received an equal volume of saline.Two rats from each group were sacrificed at the end of week 6 for pathological examination;and at the end of week 12 all rats were sacrificed.The histological examinations were performed,contents of malondialdehyde(MDA)and heme oxygenase-1(HO-1)in liver were determined.ResultsCompared with model group,the degrees of hepatic steatosis and inflammation were significantly alleviated and contents of MDA in liver were decreased in pioglitazone group(P＜0.05).The liver HO-1 levels were significantly higher in pioglitazone group than those in normal and model groups(P＜0.05).ConclusionPioglitazone can induce the expression of HO-1 in liver,which is associated with its protective effect on oxidative stress and attenuation of non-alcoholic fatty liver disease in rats.

【 Key words】 PioglitazoneNon-alcoholic fatty liver diseaseRatsOxidative sressHeme oxygenase-1

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為威脅人類健康的最常見慢性肝病之一[1]，它的發病機制尚不十分清楚，廣為大家接受的是“二次打擊”學說。雖然目前該學說受到一定的質疑，但氧應激在NAFLD疾病進展中的重要作用已得到很多學者的認可[2]。過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）γ作為一種核轉錄因子，可在轉錄水平上調控包括抗氧化酶在內的多種基因的表達，近年來，有少量國內外研究表明其激動劑-吡格列酮可抑制氧化應激的增加，而關于吡格列酮對NAFLD氧化應激的影響尚未見報道。本實驗以高脂飲食誘導大鼠NAFLD模型，用吡格列酮進行干預，觀察其對該模型鼠的作用，并檢測肝臟組織丙二醛（MDA）含量及血紅蛋白氧合酶（HO）-1的表達，探討吡格列酮對NAFLD的作用及其機制。

1　材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠30只，體質量200～220g，購自上海西普爾-必凱實驗動物SCXK（滬）公司。飼養于上海市第六人民醫院動物房，溫度（20±2）℃，12h晝夜交替，按實驗要求給予相應飼料喂養，各組動物自由進食和飲水。

1.1.2主要試劑、儀器鹽酸吡格列酮片（商品名：艾可拓，日本武田藥品工業株式會社），考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所），丙二醛（MDA）試劑盒（上海藍基生物科技有限公司），UNICO7200分光光度計（美國UNICO公司），RM2235石蠟切片機（德國Leica公司），兔抗鼠HO-1抗體（美國 Abcam公司），DAB顯色試劑盒（基爾頓生物科技上海有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1NAFLD模型復制30只SD大鼠予普通飼料適應性喂養1周后，采用隨機數字表法分為正常組、模型組和吡格列酮組，每組10只。正常組繼續飼以普通飼料，后兩組均飼以高脂飼料（各營養成分供能比例為蛋白質18.0%，脂肪45.0%，碳水化合物 37.0%，保存于4℃冰箱）。6周后每組隨機抽取2只大鼠處死，取肝臟組織行病理檢查，觀察NAFLD的造模情況。

1.2.2給藥和取材各組大鼠除繼續同前喂養外，吡格列酮組于每天固定時間給予吡格列酮10mg/kg體重（混懸液）灌胃，正常組和模型組分別給予相應體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。連續治療6周，末次給藥后，禁食12h，不禁水，氯胺酮麻醉（0.2ml/100g體重，腹腔注射）。處死后迅速取肝臟右葉的同一部位，切取數塊大小約為1.5cm×1.5cm×0.3cm的肝臟組織，放入中性甲醛溶液中固定，其余肝臟組織放入凍存管中，儲存于-80℃冰箱備用。

1.3觀察指標及方法

1.3.1肉眼觀察各組大鼠肝臟的色澤、質地等。

1.3.2組織病理學觀察取固定后的肝臟組織，常規石蠟包埋，連續切片，HE染色。顯微鏡下觀察肝臟組織學改變情況。

1.3.3肝臟組織MDA含量的測定用考馬斯亮藍法進行蛋白定量后，硫代巴比妥酸法測定MDA的含量，具體步驟按照試劑盒說明書進行，測試結果以“nmol/ mgprot”表示。

1.3.4肝臟組織內HO-1的表達行免疫組織化學染色法檢查肝臟組織細胞內HO-1的表達及分布情況。將肝臟組織石蠟切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，經抗原修復、正常血清封閉后，滴加HO-1多克隆兔抗鼠一抗后4℃過夜，次日滴加二抗，DAB顯色，經蘇木素復染后封片，陰性對照，用PBS替代一抗。光鏡下隨機選取每張切片3個不重復視野，測定陽性區域面積及光密度（OD）值。取平均OD值代表陽性表達的強弱。

1.4統計學處理采用SPSS17.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。

2　結果

2.1肝臟大體觀正常組大鼠肝臟顏色深紅，表面光滑，邊緣銳利，質地較軟；模型組肝臟較正常組體積增大、色偏黃、表面有顆粒感，邊緣變鈍、質脆、切面帶油膩，吡格列酮組大鼠肝臟色澤、質地、體積均較模型組改善，與正常組接近。

2.2肝臟組織病理學觀察光鏡下見正常組大鼠肝臟小葉結構完整清晰，肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀整齊排列，肝細胞形態大小如常，無明顯脂肪變性、炎癥細胞浸潤；模型組大鼠肝細胞小葉結構排列紊亂，多數肝細胞內可見大小不等，數量不一的脂肪空泡，肝細胞出現氣球樣變，并伴有不同程度的肝細胞碎屑樣壞死和炎癥細胞浸潤，少數存在橋接壞死，部分出現匯管區炎癥；吡格列酮組肝細胞脂肪變、炎癥程度均較模型組改善，詳見圖1。

2.3各組大鼠肝臟組織內MDA的含量模型組肝組織內MDA的含量為（1.02±0.15）mmol/mgprot，較正常組的（0.49±0.08）nmol/mgprot顯著增加（P＜0.05）；吡格列酮組為（0.55±0.11）nmol/mgprot，較模型組顯著下降（P＜0.05），且與正常組的差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1　各組大鼠肝臟組織病理學檢查所見（A：正常組；B：模型組C：吡格列酮組；HE染色，×200）

2.4肝臟組織HO-1表達的變化HO-1免疫組織化學染色顯示，正常組大鼠肝臟無明顯陽性染色，模型組大鼠肝實質細胞及肝臟組織浸潤的炎性細胞內可見到弱陽性表達，吡格列酮組大鼠肝臟組織的上述部位呈棕褐色顆粒物強陽性表達，其中胞質的染色較深，陽性染色OD值為0.31±0.04，較正常組的0.12±0.02、模型組的0.15±0.01均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

3　討論

目前，噻唑烷二酮類藥物已廣泛用于治療代謝紊亂的相關性疾病，尤其是2型糖尿病的治療，其主要機制為通過作用于PPARγ而調節脂質代謝、改善胰島素抵抗。PPARγ作為一種核轉錄因子，可與其特異性配體結合、激活，進而在轉錄水平上調控多種基因的表達。近年來國內外少數研究表明PPARγ可通過調節抗氧化、抗炎癥基因的表達，表現出非降糖降脂作用的獨立機體保護功效。如Wang等[3]研究發現活化PPARγ具有減弱急性肺損傷及呼吸窘迫綜合征過程中的炎癥反應及氧應激的作用，且該功效部分程度上與其誘導抗氧化酶HO-1，進而調節高遷移率組蛋白的表達相關。近年來，PPARγ激動劑-吡格列酮較強的抗氧化活性得到越來越多學者的關注。有研究發現，吡格列酮可降低炎癥反應從而減弱鐵所導致的黑質紋狀體多巴胺系統氧化應激，還可改善血管緊張素-Ⅱ造成的高血壓大鼠心臟收縮舒張功能紊亂，減少腎臟脂質含量及蛋白尿[4-5]，且該作用與其維持HO-1的表達，進而減弱氧應激密切相關[6]。由此可見，吡格列酮可誘導和/或維持抗氧化酶HO-1的高表達，減弱氧化應激及其相關的機體損傷。

HO-1是HO家族中的一種亞型，是血紅蛋白代謝的起始酶和限速酶。作為一種抗氧化酶，HO-1廣泛參與抗炎、抗氧化應激損傷，是機體內重要的內源性保護機制。NAFLD的發生、發展與氧化應激密切相關，最近的研究發現NAFLD患者體內HO-1的表達增加，我們的實驗結果亦顯示模型組大鼠肝臟組織內HO-1表達較正常組升高，因此，正如Wang等[7]的推測，HO-1可能是機體應對氧化應激等損傷時的一種應激性防護反應。Inoue等[8]在研究蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導非酒精性脂肪性肝炎（NASH）時發現，敲除Bach1基因（HO-1的轉錄抑制基因）組大鼠表現出HO-1高表達，同時在病理組織學上，炎癥、纖維化程度及肝臟組織內氧應激指標MDA的水平均低于對照組。因此，我們推測，誘導及維持體內HO-1高表達將有利于延緩NAFLD的進展。目前，大量臨床前及臨床試驗均表明PPARγ激動劑-吡格列酮可改善NAFLD患者的生物代謝指標和肝臟組織病理[9-10]，由此可知，吡格列酮可誘導及維持HO-1的高表達，但關于吡格列酮在NAFLD模型鼠中的抗氧化作用及其對HO-1的影響尚未見報道。本實驗以高脂飲食誘導NAFLD模型，并給予吡格列酮干預，觀察所見與眾多研究結果一致，該藥物可減輕高脂飲食所致的肝臟組織脂肪及炎癥病變，此外，吡格列酮干預組大鼠肝臟組織內抗氧化酶HO-1的表達顯著升高，進一步證實了PPARγ激動劑可上調PPARs靶基因HO-1的表達。同時，吡格列酮組大鼠肝臟組織內氧應激指標MDA的含量顯著降低，表明該藥物降低了NAFLD大鼠肝臟組織內的氧化應激。

基于NAFLD的發病機制及近年來關于吡格列酮抗氧化作用的研究基礎，本實驗自造模成功始給予吡格列酮干預治療，以研究其抗氧化作用及對HO-1表達的影響。實驗結果證實吡格列酮可增加抗氧化酶HO-1的表達，降低氧化應激，這可能是其改善NAFLD模型鼠肝臟組織病理的另一作用機制，但這一機制尚需更加深入的研究。

4　參考文獻

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（本文編輯：沈叔洪）

收稿日期：（2013-11-18）

作者單位：323800慶元縣中醫院消化內科（吳青紅）；嘉興市第二醫院消化內科（阮水良）

通信作者：阮水良，E-mail：ruanguan@aliyun.com

Effects of pioglitazone on oxidative stress in rats with non-alcoholic fatty liver disease

WU Qinghong，RUAN Shuiliang.Department of Gastroenterology,Qingyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lishui 323800,China