黃酒對TNF-α誘導的大鼠血管內皮功能的影響

趙飛 郭航遠 池菊芳 唐偉良 季政 翟小亞 倪云杰

黃酒對TNF-α誘導的大鼠血管內皮功能的影響

趙飛 郭航遠 池菊芳 唐偉良 季政 翟小亞 倪云杰

目的 探討黃酒對TNF-α誘導的大鼠血管內皮功能的影響。方法 大鼠原代主動脈血管內皮細胞（VECs）經分離培養及純化鑒定后，取第3～4代細胞用于實驗。不同濃度酒精（1．0%、1．2%、1．4%、1．6%、1．8%、2．0%）與50μg/L TNF-α共同孵育大鼠VECs）48h，MTT法檢測酒類對細胞活性的影響，確定最佳干預濃度后分為對照組、TNF-α組、TNF-α+瑞舒他汀組（10μmol/L）、TNF-α+酒精組（0．5%、1．0%、1．5%）、TNF-α+黃酒組（0．5%、1．0%、1．5%），共9組。培養24h后收集樣品，硝酸還原酶法測定培養液上清液NO的含量，化學比色法測定血漿中內皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性，免疫印跡法檢測VECs中eNOS、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達量。結果 與TNF-α組相比，瑞舒伐他汀組、黃酒1．0%組、黃酒1．5%組eNOS活力、eNOS的表達及NO含量升高（P＜0．01或0．05），ICAM-1表達降低（P＜0．01或0．05）；與瑞舒伐他汀組相比，黃酒1．0%組及黃酒1．5%組eNOS表達降低，ICAM-1表達升高（P＜0．01或0．05）。 結論 小劑量黃酒能夠增強eNOS的活力及其表達，可使NO含量增加，抑制ICAM-1表達，具有類他汀樣作用。

黃酒 動脈粥樣硬化 內皮細胞 一氧化氮 一氧化氮合酶 腫瘤壞死因子-α 細胞間黏附分子-1

動脈粥樣硬化（AS）是一種慢性疾病，它的形成是 由眾多危險因子損傷內皮而發生的一系列炎性反應，是許多心血管急性事件的重要病理基礎[1]。血管內皮細胞（VECs）是參與AS發生、發展的重要細胞。絕大多數心血管危險因素會引起內皮功能障礙，內皮穩態的破壞是AS形成的早期始動環節，與未來的心血管事件也密切相關[2-3]。近年來，國內外研究提示他汀類藥物不僅通過降脂延緩AS的發生、發展，也能通過調整NO的表達來保護VECs，可能與改善血管舒張功能、減少血管炎癥和氧化應激損傷等功能有關[4]。通過流行病學調查發現，過量飲酒有損健康，但少量、適度飲酒與心血管事件風險呈負相關[5]。黃酒由優質糯米、小麥經過獨特的發酵釀造而成。黃酒的酒精度低，含有豐富的功能性氨基酸、低聚糖、多酚類化合物及維生素和微量元素，是我國的民族特產，有多年的歷史，一直以保健養生著稱，但黃酒對心血管系統的保護作用及其可能機制方面的研究仍較缺乏[6]。本研究旨在通過研究黃酒對TNF-α誘導大鼠血管內皮功能的影響，探討其抗AS可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 SD大鼠（6周齡，200g/只）購自浙江省實驗動物中心；黃酒（五年陳瓶花雕500ml/瓶）、酒精購自浙江古越龍山紹興酒股份有限公司；M199培養基、胎牛血清（FCS）和0.25胰蛋白酶-EDTA購自美國Gibco公司；Ⅰ型膠原酶、明膠購自美國Sigma公司；血管內皮細胞生長因子（VEGF）和TNF-α購自美國PepreTech公司；鼠抗eNOS、ICAM-1單克隆抗體購自美國Abcam公司；內皮細胞培養基（ECM）及生長補充因子（ECDGS）購自美國ScienCell公司；兔抗大鼠Ⅷ因子一抗、二抗購自上?；蚩萍脊?；瑞舒伐他汀購自英國Astrazeneca公司；MTT購自美國Amresco公司；NO、NOS試劑盒購自南京建成生物技術有限公司；鼠尾膠原蛋白Ⅰ型購自杭州生友生物公司；其他免疫印跡相關試劑購自江蘇碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VECs的培養、分組 取大鼠2只，乙醚麻醉后乙醇浸泡2min消毒，分離得到光滑完整的大鼠胸腹主動脈，剪開主動脈內膜向下貼附在裝有少量0.1%Ⅰ型膠原酶溶液的玻璃皿上，37℃靜置消化30min，1 000r/min離心5min收集VECs，于0.2%鼠尾膠原包被的6孔板中培養，3～4d后，更換ECM，繼續培養5～6d可見90%以上細胞匯合成單層，形態學鑒定呈現典型的“鵝卵石”或“鋪路石”征。玻璃探針鏡下刮除少量成纖維細胞進行分離純化，D-Hanks液洗滌后，胰酶消化傳代。對原代及第2代細胞進行免疫細胞化學鑒定特異性Ⅷ因子相關抗原，可見胞質中呈棕黃色陽性表達，經純化后的第2代細胞未見明顯陰性表達細胞。取第2代細胞接種于50ml底面鋪鼠尾膠原的培養瓶中，加ECM完全培養基培養48h，待細胞融合80%左右，換無血清ECM繼續培養12h，使細胞增長同步后接種在含10%FBS ECM的6孔板中，細胞計數，每孔加VECs 2×105，臺盼藍染色鏡下測得細胞存活率約98%。各組細胞設立5個復孔。（1）對照組：正常生長的大鼠VECs；（2）TNF-α組：TNF-α50μg/L；（3）TNF-α+瑞舒伐他汀組：TNF-α50μg/L，瑞舒伐他汀10μmol/L；（4）TNF-α+黃酒組：TNF-α50μg/L，酒精度0.5%～1.5%；（5）TNF-α+酒精組：TNF-α50μg/L，酒精度0.5%～1.5%。上述各組在37℃下培養24h。

1.2.2 MTT法檢測酒類干預適宜濃度消化對數期的VECs 以3×107/L接種在96孔板含10%FBS的ECM中培養，邊緣用無菌PBS填充，24h后干預。根據預實驗結果，酒類干預濃度介于1%～2%，實驗分為對照組、TNF-α、TNF-α+1.0%、TNF-α+1.2%、TNF-α+1.4%、TNF-α+1.6%、TNF-α+1.8%、TNF-α+2.0%8組，加入的TNF-α均為50μg/L。每天換液，48h后每孔加5g/L的MTT溶液20μl，繼續培養4h，終止培養后吸掉培養液。每孔加入DMSO 150μl，搖床振蕩10min，使結晶充分溶解，490 nm處測量各孔的吸光度（A）。每組設5個復孔，2個零孔（無細胞，余同干預組）。通過前期實驗結果統一采用0.5%、1.0%、1.5%3個酒精濃度的黃酒或酒精進行干預。

1.2.3 NO含量和NOS活性的測定 采用硝酸還原酶法測定培養液上清液NO的含量，采用化學比色法測定血漿中eNOS的活性。按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 Western blotting法檢測細胞蛋白裂解上清液 以BCA法進行蛋白定量后，每道40μg蛋白上樣于（與5×上樣緩沖液充分混勻后煮沸5min，4℃12 000r/min離心5min）SDS-PAGE中恒壓電泳，積層膠60V，分離膠100 V。電泳結束后切下分離膠，濕轉法100V約1.5h轉移至PVDF膜上。電泳結束后，取下膜后先TBS洗滌3次，每次5min。然后置于5%脫脂奶粉封閉液中37℃封閉1h。將膜與封閉液稀釋的一抗4℃孵育過夜，TBST平搖洗膜3次，每次15min，然后與相應的二抗37℃孵育1h。TBST洗膜3次，去除未結合的二抗。ECL-Plus化學發光處理，于暗室中30min內壓片曝光，顯影及定影后Bio-Rad Quantity One 4.4軟件定量掃描分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t法。

2 結果

2.1 各組大鼠VECs血漿eNOS活力和NO含量 見表1。由表1可見，與對照組相比，TNF-α組eNOS活力及NO含量明顯降低（P＜0.01）。與TNF-α組相比，瑞舒伐他汀組、黃酒1%組、黃酒1.5%組eNOS活力及NO含量升高（P＜0.01或0.05）。與TNF-α組相比，黃酒0.5%組和酒精0.5%、1.0%、1.5%組eNOS活力及NO含量差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

表1 各組大鼠血漿eNOS活力及NO含量

2.2 eNOS蛋白和ICAM-1蛋白在各組內皮細胞中的表達 見圖1、2及表2。

圖1 各組eNOS蛋白的表達 [1：空白對照組，2：TNF-α組（50μg/L），3：瑞舒伐他汀組（10μmol/L），4：酒精組（0.5%），5：黃酒組（0.5%），6：酒精組（1.0%），7：黃酒組（1.0%）,8：酒精組（1.5%）,9：黃酒組（1.5%），下同]

圖2 各組ICAM-1蛋白的表達

由圖1、2及表2可見，與對照組相比，TNF-α組eNOS蛋白表達降低（P＜0.01）；與TNF-α組比較，TNF-α+瑞舒伐他汀組、黃酒1.0%組、黃酒1.5%組eNOS蛋白表達升高（P＜0.01或0.05）；與TNF-α+瑞舒伐他汀組相比，黃酒0.5%組、黃酒1.0%組及黃酒1.5%組eNOS蛋白表達降低（P＜0.01或0.05）。與對照組相比，TNF-α組ICAM-1表達升高（P＜0.01）；與TNF-α組比較，TNF-α+瑞舒伐他汀組、黃酒1.0%組、黃酒1.5%組ICAM-1表達降低（P＜0.01或0.05）；與TNF-α+瑞舒伐他汀組相比，黃酒0.5%組、黃酒1.0%組及黃酒1.5%組ICAM-1表達升高（P＜0.01或0.05）。

表2 各組eNOS蛋白及ICAM-1蛋白相對表達量比較

3 討論

內皮位于血管壁的內層,是血液與血管平滑肌細胞之間的屏障。VECs襯貼于血管腔表面，其生物學功能多樣：構成生物屏障，調節血管內外物質交換，分泌硫酸乙酰肝素，及纖維蛋白溶酶原激活劑等能抗血栓形成物質；并可作為感受器感受血管應切力，對細胞損傷作出反應等[7-9]。TNF-α可對VECs直接產生細胞毒僅應，促進中性粒細胞脫顆粒及氧化代謝，加速脂質過氧化，破壞內皮細胞結構和功能的完整性[10]，而損傷VECs，進一步釋放ICAM-1等的表達，促進單核細胞、巨噬細胞等的黏附、聚集及血管內皮下遷移作用；還可刺激內皮細胞激活血小板激活因子，使體內凝血與抗凝血系統失平衡，導致損傷部位血栓的形成；間接促進MMPs的表達，增加細胞外基質的降解，從而導致斑塊的不穩定性。

內皮細胞通過釋放血管活性物質來調節血管的反應性，NO就是內皮釋放的一個重要血管活性分子,發揮各種生理和病理作用,包括抑制血小板聚集以及黏附因子的表達，抑制單核細胞與內皮細胞黏附以及抑制血管平滑肌的增生等功能，從而發揮抗AS的效應[11]。內皮層的功能完整對于防止血管滲出和粥樣斑塊的形成有重要意義。VECs中含有豐富的eNOS，它催化底物L-精氨酸產生NO，這一過程是VECs產生NO的主要來源[12]。內皮NO是內皮細胞產生的最重要舒血管因子，具有抑制單核細胞黏附于內皮細胞的作用。NO通過其抗炎、抗血栓形成的生物學效應來維持血管的穩態。藥理學阻斷eNOS的形成會誘導內皮細胞的丟失，包括抑制內皮細胞的增殖和誘導內皮細胞的凋亡[13]。由此可見，eNOS是維持內皮細胞功能所必需的。Yang等[14]的研究表明，當eNOS的表達下調時，會使NO生成減少，進一步加重內皮損傷，導致內皮細胞功能異常，并能夠引起AS病變的發生、發展。在本研究中，與對照組相比，TNF-α組eNOS活力及NO含量明顯降低。與TNF-α組相比，瑞舒伐他汀組、黃酒1%組、黃酒1.5%組eNOS活力及NO含量升高。與TNF-α組相比，黃酒0.5%組eNOS活力及NO含量差異無統計學意義。可以發現TNF-α可對VECs造成損害，而瑞舒伐他汀和一定濃度的黃酒有保護血管內皮的功能。

Endo等[15]于1979年從紅曲霉菌的培養液中分離出抑制HMG-CoA還原酶活性的他汀類物質。較早上市的他汀類藥物是用土曲霉發酵法生產的。近年來大量國內外研究已證實他汀類藥物除了降脂作用以外，最突出的功效是改善血管內皮功能，Hol等[16]的研究結果提示他汀類藥物可以通過抗擊炎癥因子，以保護NO依賴性的冠狀動脈內皮功能。我們前期研究發現他汀類藥物除了通過降低膽固醇，還可通過保護血管內皮功能，以減慢AS的發生、發展[17]。黃酒是由麥曲發酵法生產的[18]，其營養價值高，含有豐富的氨基酸、肽類、低聚糖、有機酸、維生素及礦物質等營養成分，具有多種保健功能。在本研究中，與TNF-α+瑞舒伐他汀組相比，黃酒0.5%組、黃酒1.0%組及黃酒1.5%組eNOS蛋白表達降低，黃酒0.5%組、黃酒1.0%組及黃酒1.5%組ICAM-1表達升高。一定濃度的黃酒雖然有保護血管內皮的作用，但是作用的強度和效果仍弱于瑞舒伐他汀。

綜上所述，在本研究中我們首次發現少量黃酒具有類他汀樣的改善血管內皮功能的作用，其可能機制之一為通過增強TNF-α誘導的內皮細胞eNOS活力及NO含量，抑制TNF-α誘導的內皮細胞中ICAM-1的蛋白表達，增加eNOS蛋白表達而實現的。表明在此濃度范圍內黃酒對TNF-α誘導的內皮細胞損傷可能具有保護作用，且呈濃度依賴趨勢。并可能通過上述機制顯著抑制血管內皮炎癥反應，控制AS病理生理過程的發生、發展。

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Effects of rice wine on function in rat mice vascular endothelial cells induced by tumor necrosis factor-α

Objective To study the rice wine whether its effects are similar to statin and to study the possibility that rice wine inhibit the production of Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α)-induced endothelialnitricoxidesynthase(eNOS),nitric of rice oxide(NO)and intercellularadhesionmolecule-1(ICAM-1)in cultured rat vascular endothelial cells(VECs)．Methods Isolation,cultivation,purification and identification of VECs of rat thoracic aorta in vitro were conducted．The VECs in passages 3 and 4 were used in all studies．The VECs were incubated with one kind of wine (at the concentrations of 1．0%,1．2%,1．4%,1．6%,1．8%,2．0%) and 50ug/L TNF-αfor 48h．The optimal concentration of wine was selected．In another experiment,the cells were divided into 9 groups:control,TNF-α,TNF-α+rosuvastatin(10μlmol/L)、TNF-α+ethanol(0．5%、1．0%、1．5%)、TNF-α+rice wine(0．5%、1．0%、1．5%),and were given the corresponding treatment for 24h．Theproductionof NO was determined with nitratereductase．The activity of eNOS was then of nitric oxide (NO)was determined with nitratereductase．The activity of eNOS was then measured by means of chemicalchromatometry．The protein level of eNOS and ICAM-1 were detected by Western blotting．Results Compared with TNF-α group,the activity of eNOS,the protein expression of eNOS and the production of NO in rosuvastatin,rice wine 1．0%or rice wine 1．5%group were significantly increased．The protein expression of ICAM-1 in rosuvastatin,rice wine 1．0% or rice wine 1．5%group was significantly decreased yet．As well,compared with rosuvastatin,the protein expression of eNOS in rice wine 1．0%or rice wine 1．5%group was significantly decreased．The protein expression of ICAM-1 in rice wine 1．0%or rice wine 1．5%group was significantly increased．Conclusion Treatment with rice wine increases the activity of eNOS,the protein expression of eNOS and the production of NO,which decreases the protein expression of ICAM-1．

Rice wine Atherosclerosis Endothelial cells NO NOS TNF-α ICAM-1

2014-01-03）

（本文編輯：馬雯娜）

基因項目：紹興市科技計劃項目（2011A23011）

325000 溫州醫科大學第一臨床醫學院（趙飛、倪云杰）；紹興市人民醫院心內科（郭航遠、池菊芳、唐偉良、翟小亞、季政）

郭航遠，E-mail:ghangyuan@hotmail.com