雷帕霉素對人單核細胞來源的樹突狀細胞免疫功能的影響

駱高江 方明 姜昌浩

雷帕霉素對人單核細胞來源的樹突狀細胞免疫功能的影響

駱高江 方明 姜昌浩

目的 研究雷帕霉素對人樹突狀細胞(DC)免疫功能的影響。方法 分離外周血單個核細胞,在含粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、IL-4、胎牛血清及有或無雷帕霉素的培養條件下制備DC。用流式細胞儀檢測DC表型（CD1a、CD83、CD86、HLA-DR）；混合淋巴細胞反應（MLR）檢測DC對同種異體T淋巴細胞的刺激能力；流式細胞儀檢測DC吞噬功能和凋亡細胞數；ELISA法測定MLR上清液中的細胞因子。結果 與對照組比較,經雷帕霉素處理的DC表面CD1a、CD83、CD86、HLA-DR的表達明顯降低（均P＜0．01）；對T淋巴細胞刺激的能力下降（P＜0．01）；細胞吞噬能力下降（P＜0．01）；凋亡細胞數增加（P＜0．01），MLR中細胞因子（TNF-α、IL-10、IL-12）濃度降低（均P＜0．01）。結論 雷帕霉素對人樹突狀細胞免疫功能有明顯的抑制作用,可能是其防止冠狀動脈支架術后再狹窄的機制之一。

雷帕霉素 樹突狀細胞 免疫功能

動脈粥樣硬化（AS）是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病，炎癥和免疫是致AS發病的中心環節。樹突狀細胞（DC）被發現存在于正常動脈壁中，而在粥樣斑塊中數量明顯增多，說明DC可能在致AS的炎癥反應中起重要作用[1]。多項研究表明DC是體內最具潛能的抗原遞層細胞，在調節細胞免疫反應中起決定性作用[2]。本研究通過雷帕霉素對人單核細胞源DC的表面標志物、成熟和抗原遞呈功能、分泌細胞因子、凋亡的影響，探討雷帕霉素對人單核細胞源DC的分化、成熟及其免疫功能的影響，進一步研究雷帕霉素在AS免疫炎癥反應中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、儀器及試劑 健康志愿者的血白細胞懸液由義烏市血液中心提供，用于分離培養人外周血DC和T淋巴細胞。細胞培養箱（Forma）,倒置顯微鏡（Olympus BX 50）,常溫離心機Anke TGC-16B（上海安亭科學儀器廠）,-70℃、-20℃低溫冰箱（日本SANYO公司），24孔和6孔培養板（美國Coring公司），流式細胞儀及軟件。雷帕霉素100mg（美國ALEXIS BIOCHEMICALS公司），人重組腫瘤壞死因子-α（rhTNF-α，美國Pepretech公司），胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司），脂多糖（LPS，美國Sigma公司），人重組集落刺激因子、人重組白介素-4（rhGM-CSF、rhIL-4，美國R&D公司）,RPMI 1640培養基、人類白細胞抗原熒光標記抗體（HLA-DR-FITC）、CD83熒光標記抗體（CD83-FITC）、CD83熒光標記抗體（CD83-FITC）、CD1a熒光標記抗體（CD1a-FITC）（美國Caltag公司）,絲裂霉素C（浙江海正藥業股份有限公司）,人淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限公司）,二甲基亞砜（DMSO,Amresco Inc公司原產、上海生工生物工程有限公司分裝），5×RT碘化丙啶緩沖液（上海生工生物工程公司）；rhIL-12、rhIL-10、TNF-α的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國Biosource公司）。

1.2 方法[3]

1.2.1 DC的培養 實驗血液樣本來自9位健康志愿者，每份血液完成一組實驗，包括imDC對照組、mDC組和3個濃度梯度雷帕霉素干預組的DC免疫功能檢測。取新鮮分離的健康成人外周血白細胞懸液，用淋巴細胞分離液收集單個核細胞，再用CD14+磁珠分選出純度＞98%的CD14+單核細胞,種于含rhGM-CSF（20ng/ml）、rhIL-4（2ng/ml）、15%胎牛血清的完全培養基RPMI1640中，隔天半量換液，第5天收集懸浮細胞作為未成熟DC（imDC），加100 ng/ml的脂多糖（LPS）繼續培養2d收集起來作為成熟DC（mDC）。培養第7天在電子顯微鏡下觀察DC的形態。

1.2.2 DC的免疫功能檢測 分別用1.0、0.5、0.1μg/ml的雷帕霉素和100 ng/ml的LPS加入DC作用24h，同時以只加完全培養基的細胞做對照。然后分別做以下實驗：（1）DC的促淋巴細胞反應（MLR）：濃度為2×105/ml的淋巴細胞與濃度為2×104/ml的DC在96孔平底培養板中37℃,5%CO2條件下混合培養5 d。5 d后取上清液,-20℃保存待測細胞因子;沉淀細胞加MTT液（25孔）,繼續培養4 h后每孔加DMSO 100μl,波長540 nm處測吸光度（A值）；ELISA法檢測上述培養上清液中IL-10、IL-12、TNF-a的含量。（2）DC的表型檢測：收集干預24h的細胞分別加入單克隆抗人抗體CD1a、CD83、CD86、HLA-DR,孵育30 min,PBS洗2遍,加入FITC熒光標的二抗,孵育20 min,PBS洗2遍后懸于熒光標記液中,用流式細胞儀檢測相關數據。（3）DC的吞噬功能檢測：收集干預24h的DC，加入1mg/ml的FITC-Dextran在4℃（陰性對照）或37℃孵育30 min，用含5%FBS的PBS洗滌細胞2次，最后用200μl的PBS重懸，用流式細胞儀檢測熒光值。（4）DC的凋亡檢測:收集干預24h的DC，重懸于500μl的Binding Buffer,再加入5μl Annexin-FITC和5μl Propidium Iodide充分混勻避光，反應10min，在1h內用流式細胞儀檢測凋亡細胞數。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以表示，多組均數之間比較采用單因素方差分析（ANOVA）,兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 DC形態學特點 可見細胞聚集成簇，細胞表面大量皺褶和樹枝狀突起，胞質中細胞器豐富，為典型的DC細胞（圖1）。

圖1 樹突狀細胞聚集成簇（×40）

2.2 各組細胞表面分子表達情況 見表1。

表1 各組細胞表面分子表達陽性率情況（%）

由表 1可見，mDC組表面 CD1a、CD83、CD86、HLA-DR的表達較imDC明顯升高（均P＜0.01）；雷帕霉素干預后，imDC細胞表面分子CD1a、CD83、CD86、HLA-DR表達明顯下降（均P＜0.01）。

2.3 各組細胞吞噬功能檢測結果 FITC-Dextran陽性率imDC（4℃）組（3.35±0.31）%，imDC（37℃）組（59.76± 9.92）%，mDC組（17.62±2.68）%，雷帕霉素1.0μg/ml組（34.13±3.86）%，0.5μg/ml組（32.20±3.74）%，0.1μg/ml組（31.07±3.25）%。mDC吞噬能力較imDC明顯下降（P＜0.01）；用雷帕霉素干預后，imDC的細胞吞噬能力明顯降低（均P＜0.01）。

2.4 細胞因子定量檢測結果 見表2。

由表2可見，mDC組分泌細胞因子IL-10、IL-12和TNF-α明顯高于imDC組（均P＜0.01）；用雷帕霉素干預后，IL-10、IL-12和TNF-α明顯低于對照組（均P＜0.01）。2.5MLR imDC組和mDC組A值分別為（3.96±0.75）%和（5.78±1.16）%，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01），提示mDC刺激T淋巴細胞增殖反應能力明顯強于imDC；用1.0、0.5、0.1μg/ml的雷帕霉素干預后，A值分別為：（1.24±0.36）%、（1.30±0.34）%、（1.47±0.39）%，均明顯低于對照組（均P＜0.01），說明雷帕霉素可以明顯抑制T淋巴細胞增殖反應。

表2 細胞因子定量檢測結果（pg/ml）

2.6 雷帕霉素誘導DC凋亡情況 imDC組和mDC組凋亡細胞數分別為（7.42±0.91）%和（97.68±0.95）%；用1.0、0.5、0.1μg/ml的雷帕霉素干預后，凋亡的細胞數分別為：（12.43±1.76）%、（12.60±1.59）%、（11.75±1.26）%，均明顯高于對照組（均P＜0.01），提示雷帕霉素可以誘導imDC凋亡，mDC與imDC組差異無統計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

有關AS發病機制研究的主要理論有“損傷反應學說”，“脂蛋白改變反應學說”，以及近年來的“免疫反應假說”等[4-6]。雖然AS的具體發病機制目前尚未完全明確，但近來認為，AS發生的最初是一種免疫炎癥性反應[7-8]，在血液循環中各種刺激物質的作用下，人血管內皮細胞能夠表達多種促炎癥分子，如IL-6、血小板源生長因子（PDGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、轉化因子-B（TGF-B）和TNF-α，這些因子在AS發生過程中起了重要作用[9]。

1995年DC被發現存在于動脈壁中[10]，之后越來越多的研究表明DC在AS的發生、發展中亦具有重要作用。1997年，Wick等[11]提出了關于AS炎癥機制的全新假說——血管相關性淋巴樣組織（VALT）學說：由DC、T細胞、巨噬細胞等的聚集物組成，沿血管腔分布于動脈內膜的內皮下層，是血管組織的屏障，當有害抗原激活VALT，既而誘發局部血管壁免疫炎癥反應，最終將導致AS的發生。又有研究發現，在冠心病患者外周血中骨髓來源的DC數量明顯減少，而在AS斑塊中DC的數量較正常血管壁中明顯增加，尤其是在炎癥浸潤區域與T淋巴細胞聚集在一起[12]，提示DC遷移進入局部病變血管壁，既而提呈抗原，激活T淋巴細胞啟動免疫炎癥反應。免疫炎癥反應的發生和放大需要抗原遞呈，而DC是體內最重要的抗原遞呈細胞。外周血單核細胞是其重要來源之一，在rhGM2CSF和rh IL-24誘導下可分化為未成熟DC，此階段它具有較強的內吞、處理抗原的能力，但細胞表面缺乏協同刺激分子，MHCⅡ類分子表達很低，激發同種T淋巴細胞反應的能力較弱；當接受抗原刺激而促使其進一步分化成熟，此時其細胞表面協同刺激分子CD86上調，激活T淋巴細胞能力明顯增強，參與特異性細胞免疫反應，導致AS發生、發展。

藥物涂層支架用于心臟疾病的臨床治療，是心臟介人治療領域的一個飛躍。藥物涂層支架通過持續地向靶標血管壁的平滑肌細胞釋放抗狹窄藥物，抑制血管平滑肌細胞的過度增生，預防了支架內再狹窄的形成。涂層支架藥物釋放的靶向性特點也增加了局部損傷血管處的給藥濃度，減少了全身性藥物毒性，較全身給藥預防支架內再狹窄的效果理想[13]。目前，雷帕霉素藥物涂層支架在全世界廣泛使用[14]。雷帕霉素與細胞內受體FKBP12結合后，作用于靶蛋白mTOR,最終抑制細胞周期依賴性蛋白激酶（CDKI）家族中p27Kip1的降解。p27Kip1在血管平滑肌細胞的細胞周期調節中發揮著重要作用，其濃度的增加抑制了細胞進人S期所必需的pRb（視網膜母細胞瘤蛋自）磷酸化過程，導致G1期-S期的細胞周期停滯，抑制了平滑肌細胞的增生以及細胞從平滑肌中層向內膜的遷移過程[15]。到目前為止，大多數的研究主要關注雷帕霉素對內皮細胞和平滑肌細胞的抑制作用，但是，很少有人關注雷帕霉素對免疫炎性細胞的直接作用，尤其是對DC的作用。本實驗通過查找國內外大量文獻，雷帕霉素取1.0、0.5、0.1μg/ml 3個濃度[16]，采取干預imDC，用不加藥物的imDC作為空白對照，同時添加100 ng/ml LPS后培養為成熟DC亦進行比較。用流式細胞術檢測，經雷帕霉素干預后的imDC細胞表面分子CD83、CD86、CD1a、HLA-DR的表達明顯下降，不同濃度的雷帕霉素干預后，CD83、CD86、CD1a、HLA-DR的表達沒有明顯差異，說明雷帕霉素能夠抑制DC的分化和成熟，但無濃度梯度差異。用流式細胞術檢測DC吞噬Dextran的濃度，經LPS干預DC的吞噬能力明顯低于對照組，說明成熟DC的吞噬能力較未成熟DC降低；用雷帕霉素干預imDC，細胞的吞噬能力均明顯下降，但沒有隨著濃度的增加而吞噬能力下降，說明雷帕霉素能夠抑制DC的吞噬功能，而抑制DC吞噬功能無濃度相關。ELISA法細胞因子定量檢測表明，成熟DC分泌細胞因子IL-10、IL-12和TNF-α能力較未成熟DC強，而雷帕霉素能夠抑制imDC分泌細胞因子IL-10、IL-12和TNF-α。用MTT法檢測MLR，mDC可以產生與對照組有差異的MLR，經雷帕霉素干預的imDC可以產生與對照組有差異的MLR，說明mDC使T淋巴細胞增殖反應加強，而雷帕霉素可以使DC對T淋巴細胞增殖反應下降[17]。用流式細胞術檢測DC凋亡，雷帕霉素可以誘導imDC凋亡，但無明顯濃度差異，mDC和imDC比較，無明顯差異。本實驗雷帕霉素僅選了3個濃度，而且藥物作用只選了24h，故實驗結果只能代表雷帕霉素作用24h的結果，具體48、72h甚至更久時間作用的結果待以后進一步實驗明確，同時應增加濃度梯度使實驗結果進一步完善。

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Effects of rapamycin on immune function of human monocyte-derived dendritic cells

Objective To investigate the effects of rapamycin on immune function of human monocyte-derived dendritic cells(DC)． Methods Human monocytes were isolated and cultured with fetal bovine serum,granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(rhGM-CSF)and interleukin-4(rhIL-4)with or without rapamycin．Allogeneic T cell activation by DCs was tested by mixed lymphocyte reaction(MLR)．ELISA was used to detect the expression of IL-10,IL-12 and TNF-α．The immunophenotype,cell apoptosis and endocytic activity of DCs were measured by flow cytometry． Results The level of CD1a, CD83,CD86 and HLA-DR in rapamycin treatment group was lower than those in control group(P＜0．01)．Rapamycin inhibited the endocytic and T-cell stimulating activity of DCs(P＜0．01),induced DC apoptosis,and decreased the secretion of IL-10,IL-12 and TNF-a(P＜0．01)．Conclusion Rapamycin can inhibit the immune function of human monocyte-derived dendritic cells,which may be one of the mechanisms for prevention of in-stent restenosis．

Rapamycin Dendritic cells Immune function

2014-01-09）

（本文編輯：馬雯娜）

義烏市科研計劃項目（項目編號：12-3-26）作者單位：322000 義烏市中心醫院心內科

駱高江,E-mail:luogaojiang@sohu.com