中藥紅曲對高脂血癥大鼠PPARγ和脂聯素受體表達的影響

林希 周毅 徐苗苗 林祥 邵深深 朱雪瓊 郎瑋

中藥紅曲對高脂血癥大鼠PPARγ和脂聯素受體表達的影響

林希 周毅 徐苗苗 林祥 邵深深 朱雪瓊 郎瑋

目的 探討中藥紅曲對高脂血癥大鼠主動脈過氧化物酶體增殖物活化受體γ（PPARγ）和脂聯素受體1和2（AdipoR1/AdipoR2）mRNA的影響。方法 SPF級雄性SD大鼠36只,隨機數字表法分為正常組（12只）和高脂組（24只），高脂飼料喂養12周后高脂組造模成功，隨機分為模型組和紅曲組，每組12只，分別予0．9%氯化鈉溶液和紅曲水提液灌胃4周，檢測血脂水平，HE染色觀察主動脈病理改變，Western boltting檢測PPARγ表達，ELISA檢測血清脂聯素水平,實時熒光定量PCR檢測AdipoR1/AdipoR2 mRNA的表達。結果 高脂組TG、TC和LDL-C升高，HDL-C下降（P＜0．05）；給藥4周后，與模型組比較，紅曲組TG、TC和LDL-C降低（P＜0．01或0．05），HDL-C升高（P＜0．05）；紅曲組血清脂聯素、AdipoR1和AdipoR2 mRNA的表達較模型組升高（P＜0．05或0．01）。結論 紅曲能降低高脂血癥大鼠血脂水平，其機制可能與增加主動脈PPARγ蛋白的表達，升高血清脂聯素水平及AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達有關。

高脂血癥 主動脈 紅曲 過氧化物酶體增殖物活化受體γ 脂聯素 脂聯素受體

高脂血癥的一個重要特點是脂蛋白在血管內皮沉積所引起的動脈粥樣硬化。氧化修飾的脂蛋白可以使巨噬細胞聚集，反過來巨噬細胞又可以攝取氧化修飾的脂蛋白而成為泡沫細胞，逐漸形成動脈粥樣硬化[1]。動脈粥樣硬化的發生和發展與高血壓、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病密切相關。PPARγ是一類受配體激活的轉錄因子，它是核受體超家族的成員，可以調節某些特定的基因轉錄，同時具有調節血脂，控制血管炎癥，增強胰島素敏感性等作用。脂聯素是近年來新發現的由白色脂肪組織分泌的一種激素，參與糖脂代謝，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、改善胰島素抵抗等生物學效應[2]。脂聯素受體分為兩個亞型，即AdipoR1和AdipoR2。有研究證實AdipoR受到PPARγ的調控，PPARγ的激活可以促使脂聯素的表達和釋放[3]。紅曲，古稱“丹曲”，是由紅曲霉屬真菌接種于大米上經過發酵制備而成。據《本草綱目》記載，紅曲具有消食活血、健脾養胃等功能。現代研究發現紅曲也具有降血脂作用[4]，這可能與紅曲中具有的天然他汀類物質Monacolin K（莫納可林K，又稱酸式洛伐他汀）密切相關。故本研究擬在建立高脂血癥大鼠動物模型的基礎上，探討紅曲對血脂、PPARγ和脂聯素及相關受體的影響，為其治療高脂血癥及相關疾病提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器 SPF級雄性SD大鼠36只，體重180～220g，由溫州醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號為SYXK（浙）2013-0032。紅曲水提液由溫州醫科大學溫州市第三臨床學院中藥房提供,含生藥0.625g/ml；PPARγ兔抗大鼠一抗，β-actin兔抗小鼠一抗、HRP標記的山羊抗兔二抗（美國Santa Cruz公司）；脂聯素ELISA試劑盒（上海朗卡生物有限公司）；7600-110全自動生化分析儀（日本HITACHI公司）；蛋白電泳轉移系統（Bio-Rad公司）；全波長掃描多功能酶標儀（美國BIO-TEK公司）；Trizol抽提試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（加拿大Fermentas公司）；SYBR Green染料、LightCycler 480 PCR儀（德國Roche公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 所有動物適應性喂養1周后，根據隨機數字表法分為正常組（12只）和高脂組（24只），正常組給予普通飼料喂養，由溫州醫科大學動物實驗中心提供。高脂組大鼠給予高脂飼料（7.5%豬油、2%膽固醇、5%蛋黃粉、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.3%去氧膽酸鈉、85%基礎飼料），喂養12周后，禁食過夜，眼球后靜脈取血3ml,室溫下靜置1h，3 000r/min離心5min，測血脂4項。隨后將高脂組再隨機分為兩組（每組各12只）：模型組在給予高脂飼料的基礎上每天以0.9%氯化鈉溶液10ml/ kg灌胃；紅曲組在飼以高脂飼料基礎上每天以紅曲水提液10ml/kg灌胃，持續4周。給藥劑量根據大鼠體重變化適時調整。4周末，大鼠禁食過夜，以6%水合氯醛腹腔麻醉后，左心室穿刺取血3ml，3 000r/min離心5min，分離血清進行血清指標測定；分離處于麻醉狀態的大鼠胸主動脈，用于HE染色及其他指標測定。

1.2.2 血清標本測定 使用全自動生化分析儀測定TG、TC、LDL-C和HDL-C水平；根據ELISA試劑盒說明書檢測血清脂聯素含量。

1.2.3 HE染色 取主動脈中段（約0.5cm），4%多聚甲醛固定過夜，進行石蠟包埋,連續切片,切片厚度為0.5μm，切片脫蠟、水化，HE染色，光鏡下觀察。

1.2.4 Western blotting檢測PPARγ蛋白表達 在加入細胞裂解液后，將主動脈勻漿，提取總蛋白，采用BCA試劑盒進行蛋白測定，取60μg蛋白，配成20μl體系。經電泳、轉膜、封閉后置于PPARγ一抗（稀釋度為1∶1 000），4℃孵育過夜。取出PVDF膜，洗膜5min×6次，加辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育2h。TBST洗膜5min×6次，用ECL發光液（試劑A∶試劑B=1∶1）覆蓋膜，曝光后進行分析計算。

1.2.5 Real-time PCR檢測AdipoR1/2 mRNA的表達 用Trizol一部法抽提總mRNA。根據逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄。PCR引物序列：AdipoR1上游引物5＇-TGGGGAAAAAATTATGAACTGG-3＇，下游引物5＇-GTGTGCTACAAAAATGGATGGC-3＇，擴增產物為132bp；AdipoR2上游引物5＇-TGCGCACACGTTTCAGTCTCCT-3＇，下游引物5＇-TTCTATGATCCCCAAAAGTGTGC-3＇，擴增產物為150bp；β-actin上游引物5＇-GCAGAAGGAGATCACAGCCCT-3＇，下游引物5＇-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3＇，擴增產物為136bp。配置20μl PCR反應體系，用LightCycler 480 PCR儀檢測。擴增條件為：95℃5s，60℃1min，72℃30s，共40個循環；Ct值為每個管內熒光信號達到預先設定的閾值所經歷的循環數。記錄LightCycler 480軟件中各指標與內參的Ct值進行統計分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件，計量資料先進行正態性和方差齊性檢驗，以表示，兩組比較采用兩樣本t檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠主動脈形態學改變 正常組大鼠主動脈內皮完整光滑，平滑肌分布均勻，未見增生；模型組大鼠平滑肌增生，內膜明顯增厚，細胞腫脹肥大，排列紊亂，脂質空泡化；紅曲組平滑肌增生不明顯，內皮尚完整，細胞偶有排列不規則（圖1）。

圖1 各組主動脈形態學改變（A：正常組；B：模型組；C：紅曲組；HE染色，×200）

2.2 各組大鼠血脂水平比較 見表1、2。

表1 喂養12周后各組大鼠血脂水平比較（mmol/L）

表2 灌胃干預4周后各組大鼠血脂水平比較（mmol/L）

由表1、2可見，喂養12周后，高脂組大鼠TG、TC、LDL-C較正常組升高（均P＜0.01），HDL-C較正常組降低（P＜0.05）。經灌胃干預4周后，模型組TG、TC、LDL-C較正常組升高（均P＜0.01），HDL-C較正常組降低（P＜0.05）；而紅曲組TG、TC、LDL-C較模型組降低（P＜0.01或0.05），HDL-C較模型組升高（P＜0.05）。

2.3 紅曲對大鼠主動脈PPARγ蛋白表達的影響 紅曲組PPARγ蛋白相對表達量為0.913±0.112、模型組為0.505±0.024、正常組為1.432±0.132，模型組PPARγ表達較正常組減少（P＜0.01），使用紅曲干預后PPARγ表達較模型組明顯增加（P＜0.01），見圖2。

圖2 紅曲對高脂血癥大鼠主動脈PPARγ蛋白相對表達量的影響

2.4 各組血清脂聯素和AdipoR1/AdipoR2 mRNA的表達情況 見表3。

表3 各組血清脂聯素和AdipoR1/AdipoR2 mRNA的表達情況

由表3可見，與正常組比較，模型組血清脂聯素、AdipoR1和AdipoR2 mRNA水平下降（P＜0.01或0.05），紅曲組脂聯素、AdipoR1和AdipoR2 mRNA水平較模型組升高（P＜0.05或0.01）。

3 討論

紅曲是在經過蒸煮的糧食或利用天然菌種（霉菌、細菌、酵母菌）培養發酵形成的。紅曲作為一種混合微生物發酵劑，其在發酵過程中的各種代謝產物具有顯著的醫療作用。紅曲霉產生的物質如阿魏酸及其衍生物，具有抗氧化、抗癌、抗菌及調控血壓等效果[5]。在清酒的發酵過程中，酒曲分泌的葡萄糖苷酶則具有護肝和加強角質分化形成細胞的功效。20世紀70年代日本學者Endo從紅曲米中發現了能夠降低人體血清膽固醇的天然他汀類物質Monacolin K[6]，引起了全世界對紅曲的關注。功能紅曲的主要成分Monacolin K的開環酸形式與HMG-CoA結構相似，因此能夠競爭性地與HMGCoA還原酶結合從而抑制體內膽固醇的合成過程，阻斷細胞內HMG-CoA向甲羥戊酸轉化，抑制膽固醇的合成[7-8]。

PPARs是一類受過氧化物酶體增殖物激活的核受體，在脂質代謝中發揮著重要作用。PPARs根據不同的結構和功能分為α、β、γ三種亞型。PPARγ主要在胰島素的相關靶組織（脂肪、肝臟、骨骼肌）中表達，可被多種脂肪酸及相關衍生物激活，是體內脂肪酸的感受器。PPARγ被激活后，可以調節某些特定的基因轉錄以及誘導一系列脂質代謝相關酶的表達，以減少脂質代謝負荷，改善脂肪變性[9]。有研究發現由美國默莎東公司化學合成的洛伐他汀可以通過上調PPARγ等的表達阻止ApoE基因敲除老鼠的動脈硬化及膽固醇在泡沫細胞的聚集[10]。脂聯素是體內脂肪組織中含量最豐富的基因轉錄產物，也是唯一與體脂含量呈負相關的脂肪因子。它可以抑制肝臟脂肪合成，促進脂肪氧化分解，增強周圍組織對胰島素的敏感性，抑制炎癥因子產生，對抗氧化應激和纖維化。臨床研究顯示低水平的脂聯素是高血壓、冠心病、糖尿病的獨立危險因素；而高水平的TG與低脂聯素水平密切相關，易出現血管損傷，加速動脈粥樣硬化[11]。同時實驗研究也提示脂聯素在高血壓、心血管疾病和胰島素抵抗的發展中起著保護作用[12]。有研究對于血脂異常的非糖尿病患者給予阿托伐他汀（一種新型的HMG-CoA還原酶抑制劑）治療后其血清脂聯素水平明顯升高，總膽固醇和低密度脂蛋白均不同程度降低[13]。

噻唑烷二酮類（TZDs）（如吡格列酮和曲格列酮）是合成的PPARγ選擇性激動劑，它與PPARγ結合后可以促使與胰島素抵抗相關的脂肪因子（如脂聯素、抵抗素、TNF-α等）的表達與釋放。Maede等[14]在一組輕度超重的糖耐量異常患者中應用曲格列酮治療1～2周后發現受試者血漿脂聯素水平明顯升高。動物實驗發現高脂血癥大鼠在使用了吡格列酮進行干預后其血脂降低，脂聯素受體AdipoR1/2 mRNA明顯升高[15]。而在參與動脈粥樣硬化形成的單核巨噬細胞使用PPARγ激動劑可上調AdipoR1/2的表達[16]。本研究發現，紅曲能降低血脂，逆轉主動脈的病理改變，增加PPARγ的表達，同時可以提高脂聯素的水平和促進AdipoR1/2 mRNA表達，提示紅曲可能通過PPARγ對脂聯素及其相關受體進行調控從而發揮降脂作用。

本研究中，我們發現紅曲作為天然來源的他汀類物質具有明顯降脂作用，這可能與紅曲作用后可以提高PPARγ表達和增加血清脂聯素及AdipoRmRNA水平有關。近年來，許多的紅曲制劑如脂必妥、紅曲膠囊、血脂康膠囊等相繼投入國內市場，它們不僅具有較好的降脂效果，且作用緩和、不良反應小。因此，紅曲防治高脂血癥及其相關疾病具有現實意義及廣闊前景。

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Effect of red kojic rice on expression of PPARγ and adiponectin receptors in hyperlipidemic rats

Objective To investigate the effect of red kojic rice on expression of aorta peroxidase proliferator-activated receptor γ(PPARγ)and adiponectin receptor 1 and adiponectin receptor 2(AdipoR1 and AdipoR2)mRNA in hyperlipidemic rat．Methods Thirty-six SPF male SD rats were randomly divided into control group(n=12)and hyperlipidemia group(n=24)．Hyperlipidemia was induced by feeding high-fat diet for 12 weeks．The hyperlipidemic rats were further divided into model group and treatment group (n=12 in each group),rats in two groups were given 0．9%normal saline and red kojic rice by gavage for 4 weeks, respectively．Serum lipid levels were measured and pathological changes in aorta were observed with HE staining．The expression of PPAR γ was detected by Western blotting;serum adiponectin was measured by ELISA;AdipoR1 and AdipoR2 mRNA was detected by real time RT-PCR．Results After twelve weeks of high fat feeding,the triglyceride (TG),total cholesterol(TC)and low density lipoprotein cholesterol(LDL-C)in hyperlipidemia group increased significantly (P＜0．01),and high density lipoprotein cholesterol(HDL-C)decreased (P＜0．05)．Four weeks after administration,compared with the model group,the TG,TC and LDL-C in the treatment group were significantly decreased(P＜0．01 or 0．05),while HDL-C increased(P＜0．05)．The aortic intimal thickening and the proliferation of smooth muscle cells were decreased,the expression of PPAR γ and AdipoR1/AdipoR2 mRNA was increased in treatment group compared to model group．Conclusion Red kojic rice can lower the levels of blood lipids in hyperlipidemic rats,which may be related to u aortic PPARγ protein expression and AdipoR1/AdipoR2 mRNA expression．

Hyperlipidemia Aorta Red kojic rice Peroxidase proliferator-activated receptor γ Adiponectin Adiponectin receptor

2014-04-14）

（本文編輯：楊麗）

325000 溫州醫科大學溫州市第三臨床學院、溫州市人民醫院中醫科（林希、周毅、徐苗苗、林祥、邵深深、朱雪瓊）；溫州醫科大學附屬第一醫院中醫科（郎瑋）

郎瑋，E-mail：Langwei808@126.com