苯并[a]芘誘導小鼠腹主動脈瘤形成機制研究

蔣鳳春 季亢挺 隋向前 唐疾飛

苯并[a]芘誘導小鼠腹主動脈瘤形成機制研究

蔣鳳春 季亢挺 隋向前 唐疾飛

目的 探討香煙煙霧重要成分苯并[a]芘（BaP）誘導小鼠腹主動脈瘤（AAA）形成的相關機制。方法 48只7～9月齡C57BL/6N小鼠分為對照組、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）組、BaP組、AngⅡ/BaP復合物組。5周后取各組小鼠腹主動脈觀察大體標本形態,切片行HE染色觀察血管結構；免疫組化法檢測各組靶血管基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）、核轉錄因子-κappaB（NF-κB）的表達, POD法TUNEL檢測血管平滑肌細胞凋亡情況。結果 大體標本顯示AngⅡ/BaP復合物組腹主動脈瘤形成率為41．67%，明顯高于AngⅡ組腹主動脈瘤形成率25．00%（P＜0．05），HE染色提示動脈瘤形成處彈性纖維紊亂血管壁顯著變薄。免疫組化提示AngⅡ/BaP復合物組MMP-3及NF-κB的表達均較AngⅡ組及BaP組增加 [（0．48±0．13）%vs（0．24±0．16）%，（0．34±0．10）%；（0．42± 0．12）%vs（0．23±0．06）%，（0．32±0．09）%，均P＜0．05]。AngⅡ/BaP復合物組平滑肌細胞凋亡較AngⅡ組及BaP組更明顯[（30± 12）%vs（19±5）%，（23±4）%，均P＜0．05]。結論 BaP在AngⅡ協同作用下可促進老齡C57BL/6N小鼠形成AAA，其機制可能與BaP通過NF-κB促進MMP-3的表達使彈性纖維紊亂及平滑肌細胞凋亡有關。

苯并[a]芘 腹主動脈瘤 基質金屬蛋白酶-3 核轉錄因子-κappaB 平滑肌細胞

多環芳烴是含有2個或2個以上苯環的芳香族化合物，該類物質性質穩定，分布廣泛，其中香煙煙霧的重要成分之一苯并[a]芘（BaP）就是多環芳烴的代表物質。有研究證實每天吸1包無過濾嘴香煙或過濾嘴香煙，人體分別吸收700ng或400ng的BaP即相當于6～10μg的多環芳烴。已知吸煙是腹主動脈瘤（AAA）的誘發因素之一[1-2]，且在眾多香煙煙霧的成分中，BaP可引起血管壁的病理學改變[3-4]，并可導致血管組織中核轉錄因子κappaB（NF-κB）激活[5]、基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）表達上升、平滑肌細胞凋亡等改變，且類似的改變也可在人類AAA中觀察到，由此我們推測BaP對AAA形成可能有促進作用。鑒于國內吸煙人口眾多且AAA發病率不斷上升，而AAA的防治措施缺乏。本實驗研究BaP對AAA發生、發展的影響，為AAA的預防及治療提供策略。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 雄性SPF級C57BL/6N小鼠，7～9月齡，體重35～40g；購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。單籠飼養于溫州醫學院附屬第二醫院科研中心SPF級實驗動物房；飲用純凈水，標準飼料喂養，自由飲食；生活節律為晝夜12h，保持恒溫恒濕。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）-A9525，BaP-B1760均購自美國Sigma公司；中鏈甘油三酯-WL1349，購自法國嘉法獅公司，其對機體無害，在實驗中作為BaP的溶劑；藥物微量滲透泵（Osmotic Pump，Model 2004；0.25μl/h，4W）為美國Alzet公司生產。NF-κB、MMP-3試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。POD法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 采用完全隨機分組法將小鼠分為4組，對照組、AngⅡ組、BaP組和AngⅡ/BaP復合物組，每組12只。對照組：腹腔注射中鏈甘油三酯5ml/kg，1次/周；AngⅡ組：2%戊巴比妥鈉40mg/kg，腹腔注射麻醉，俯臥位固定，背部肩胛處備皮、消毒，作長約1cm切口，皮下埋置AngⅡ微量緩釋泵（AngⅡ溶于無菌0.9%氯化鈉溶液，每只泵均注入168μl的AngⅡ溶液,放置于37℃水浴箱中12h備用，藥物緩釋泵持續釋放AngⅡ0.72mg/（kg·d），釋放速度0.25μl/h，持續4周），同時腹腔注射中鏈甘油三酯5ml/kg，1次/周；BaP組：以10mg/ kg的劑量溶解于中鏈甘油三酯配制成2mg/ml的溶液，每周5ml/kg，進行腹腔注射；AngⅡ/BaP復合物組：背部植入AngⅡ滲透泵，同時腹腔注射溶解于中鏈甘油三酯的BaP，5ml/kg，1次/周，劑量及方法同前。

1.2.2 病理標本取材和制作 （1）給藥5周后，小鼠經2%戊巴比妥鈉麻醉后仰臥位固定，打開胸腹腔，暴露心臟行0.9%氯化鈉溶液心臟灌注，待肺組織呈白色后繼續4%多聚甲醛灌注15min，在解剖顯微鏡下分離腹主動脈，取出腹主動脈后拍照。取靶血管置于10%的甲醛溶液中繼續固定24h。（2）梯度乙醇脫水，包埋，間斷切片，切片厚度4μm，行HE染色觀察血管形態，應用ImageJ專業分析軟件測血管周長。取每只小鼠腹主動脈12個不同橫截面進行測量，測得單只小鼠腹主動脈平均周長，并以此計算各組小鼠腹主動脈平均周長；如各處理組內有小鼠腹主動脈最大周長大于對照組平均血管周長的50%，視為腹主動脈瘤形成。

1.2.3 免疫組化測定 以抗MMP-3抗體、單克隆抗NF-κB抗體行免疫組化染色評估MMP-3、NF-κB在AAA大動脈壁的激活及表達。具體方法：取血管標本石蠟包埋，切片，采用免疫組化SP法，常規脫蠟、水化、高壓抗原修復、去除內源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗4℃過夜、加生物素化二抗、DAB顯色、蘇木素復染、透明、封片。采用IPP軟件分析：每個標本取3張切片，每張切片取5個視野,分別計算陽性染色面積、有效統計面積,以陽性染色面積在有效統計面積所占的百分比為測定標準,檢測MMP-3及NF-κB的表達,取平均值，并以此計算各組MMP-3及NF-κB的表達。

1.2.4 POD法檢測TUNEL細胞凋亡 腹主動脈石蠟切片脫蠟至水，PBS洗滌5min×2次，用蛋白酶細胞通透8min。加5μl TdT+45μl熒光素標記的dUTP（TUNEL反應液），暗盒內37℃×1.5h。PBS洗滌5min×3次，玻片干后加50μlconverter-POD于標本上37℃×30min，PBS洗滌5min×3次，DAB顯色,蘇木素復染樹膠封片。陽性染色細胞呈現核質固縮、邊緣化，核膜裂解。采用IPP軟件分析：每個標本取3張切片，每張切片取5個視野,選擇測定區域計數每視野中血管壁凋亡細胞的數量及細胞總數，計算血管壁單位面積內凋亡細胞比率，取平均值，并以此計算各組血管壁凋亡細胞百分比。

1.3 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 腹主動脈瘤模型建立 腹主動脈大體標本顯示AngⅡ組、AngⅡ/BaP復合物組均有腹主動脈瘤形成，其中對照組腹主動脈平均周長（938±108）μm；AngⅡ組腹主動脈平均血管周長（1 204±230）μm，組內有3只小鼠靶血管周長＞1 407μm，AAA形成率為25.00%；BaP組腹主動脈平均血管周長（1053±103）μm，組內無小鼠靶血管周長＞1 407μm；AngⅡ/BaP復合物組腹主動脈平均血管周長（1 399±245）μm，有5只小鼠靶血管周長＞1 407μm，AAA形成率為41.67%。AngⅡ組腹主動脈周長大于對照組（t=3.26，P＜0.01），而AngⅡ/BaP復合物組腹主動脈周長顯著大于對照組、AngⅡ組及BaP組（t= 6.23、2.57、4.73，均P＜0.01）。

2.2 BaP促進血管壁彈性纖維紊亂 處理5周后取小鼠腹主動脈1cm，石蠟包埋、切片后行HE染色，與對照組相比，AngⅡ組、BaP組、AngⅡ/BaP組血管中層均有不同程度破壞，管壁變薄；AngⅡ/BaP復合物組由于中層破壞、膠原纖維退變、彈力纖維紊亂不能耐受主動脈內血流壓力而發生動脈瘤破裂，局部膨大形成血腫。AngⅡ組血管壁變薄，較BaP組明顯，見插頁圖1。

2.3 各組小鼠靶血管MMP-3、NF-κB的表達 見表1。

表1 各組小鼠靶血管MMP-3、NF-κB的表達（%）

由表1可見，AngⅡ組、BaP組及AngⅡ/BaP復合物組 MMP-3、NF-κB表達均較對照組增加，BaP組MMP-3、NF-κB表達較AngⅡ組增加（均P＜0.01）；AngⅡ/BaP復合物組MMP-3、NF-κB表達增加最明顯，大于AngⅡ組（均P＜0.01）。

2.4 各組小鼠腹主動脈平滑肌細胞凋亡 平滑肌細胞凋亡率對照組為（4±2）%，AngⅡ組、BaP組及AngⅡ/BaP復合物組分別為（19±5）%、（23±4）%、（30±12）%，均高于對照組（均P＜0.01），而AngⅡ/BaP復合物組平滑肌細胞凋亡率高于AngⅡ組及BaP組（t=3.67、2.27，均P＜0.05），見插頁圖2。

3 討論

據WHO統計，每年有數百萬人因吸煙而失去生命[6]，這引起了人們對香煙煙霧的重視及研究。已有研究證實吸煙可提高腹主動脈瘤的發生率。可見香煙煙霧的成分促進了腹主動脈瘤的形成，但具體是哪種成份尚未證實。AAA的主要病理特征是炎癥、彈性纖維退變、血管平滑肌細胞減少[7]。本實驗結果顯示，BaP可引起C57BL/6N小鼠腹主動脈血管壁彈性纖維紊亂，平滑肌細胞凋亡；而同時用BaP和血管緊張素處理的小鼠腹主動脈血管壁彈性纖維紊亂及血管平滑肌細胞丟失更加顯著，且AAA的發生率（42%）要明顯高于僅用AngⅡ（25%）處理的小鼠。這一結果提示在小鼠腹主動脈瘤的發生、發展中BaP及AngⅡ起著協同作用。

AAA的病理過程中最顯著的變化是細胞外基質的主要成分彈性纖維網絡的瓦解和退變[8]。MMP-3又稱間質溶解素1，病理狀態下參與腹主動脈瘤、動脈粥樣硬化、骨關節炎等的發生與發展，其活性增加可促進動脈壁上彈性纖維退變。有研究發現[9]，MMP-3在AAA中的活性較正常動脈增高。此外動脈壁中膜的主要細胞成分平滑肌細胞的生長需依賴細胞外基質的維持，在AAA病程中因MMP-3表達增加，細胞外基質大量降解不足以支持平滑肌細胞的正常生長而導致大量平滑肌細胞的凋亡。我們的數據顯示：BaP可促進C57BL/6N小鼠腹主動脈血管壁MMP-3的表達，BaP聯合AngⅡ使用后小鼠腹主動脈血管壁MMP-3顯著增加，且平滑肌細胞凋亡明顯，綜上提示BaP對小鼠腹主動脈瘤形成與MMP-3有關。

NF-κB是一個多效而保守的轉錄因子，它是促進炎癥基因表達的樞紐，可調控炎癥性細胞因子、趨化因子、轉錄因子、細胞表面受體、黏附因子等的表達，控制著機體防御、組織應激、細胞調亡等許多重要的生理及病理反應過程。在AAA的病理改變中，NF-κB對MMPs表達起著調控作用。抑制NF-κB的活性可顯著降低動脈瘤形成概率，并且伴隨著MMPs表達的下降。結果提示，香煙煙霧成分BaP可在AngⅡ協同作用下激活NF-κB通路，使MMP-3表達增加，進而促使彈性纖維紊亂及平滑肌細胞凋亡，最終形成AAA。

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Benzo［a］pyrene(BaP)promotes abdominal aortic aneurysm formation in mice and its mechanism

Objective To investigate the effect of benzo［a］pyrene(BaP)on the formation of abdominal aortic aneurysm (AAA)in mice and its mechanism．Methods C57BL/6N mice aged 7～9 months were divided into four groups,control group, angiotensinⅡ(AngⅡ)group,BaP group and AngⅡ/BaP group．After 5 weeks of treatment of various agents the abdominal aortas of mice were taken．Aortic tissues were subject to HE,immunochemistry staining for evaluation of vascular wall structure,the expression of matrix metalloproteinase-3,nuclear factor-κB and the apoptosis of vascular smooth muscle cells．Results AngⅡinfusion with BaP injection induced AAA in 41．67%of mice (versus 25%in AngⅡgroup,P＜0．05)．Histological analysis of the aortic wall showed severe damage to the medial layer and breakage of elastic lamella．Immunohistochemistry staining showed that the expression of MMP-3 and NF-κB were increased in AngⅡ/BaP group compared with AngⅡand BaP group(0．48± 0．13%vs 0．24±0．16%and 0．34±0．10%,P＜0．05;0．42±0．12%vs 0．23±0．06%and 0．32±0．09%,P＜0．05)．The apoptosis of aortic vascular smooth muscle cells was highest in AngⅡ/BaP group compared with AngⅡand BaP group(30±12%vs 19±5% and 23±4%,P＜0．05)．Conclusion BaP promotes AngⅡ-induced AAA formation in aging C57BL/6N mice,which may be associated with activating NF-κB,up-regulation of MMP-3 expression,resulting in disarray of elastic lamella,apoptosis of vascular smooth muscle cells,vascular structural destroy and ultimately aneurysm formation．

Benzo(a)pyrene Abdominal aortic aneurysm Matrix metalloproteinase-3 Nuclearfactor-κappa B Smooth muscle cells

2014-03-24）（本文編輯：楊麗）

浙江省自然科學基金（Y2110550）

310003 杭州市紅會醫院心內科（蔣鳳春、隋向前）；溫州醫科大學附屬第二醫院心內科（季亢挺、唐疾飛）