細胞因子和microRNA與結核分枝桿菌感染的研究進展

蔣紓芳，張嶸，馮曉燕

1.軍事醫學科學院 基礎醫學研究所，北京 100850；2.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016

結核病是結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所致的以呼吸系統感染為主的慢性傳染病。近年來，結核疫情愈發嚴重，其感染后患者的病亡率位居我國傳染病的首位。大多數人感染MTB 并無臨床癥狀，稱為結核潛伏感染[1]。研究表明，5%～10%的潛伏結核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）人群可轉化成活動性結核病[2]，這表明遺傳因素在調節MTB 感染的過程中扮演著非常重要的角色[3]。潛伏感染不斷轉變成活動性結核，是造成結核病發病率居高不下的重要原因。因此，LTBI為結核病的控制和診斷帶來了巨大挑戰。聯合國已將結核病列為21世紀重點控制的三大疾病之一。

MTB 是胞內寄生菌，侵入機體內是否發病不僅與感染細菌的毒力和數量等因素相關，還與機體的免疫功能相關。當機體感染MTB 后，胞內寄生的特點使它免于抗體的攻擊，因此，普遍認為細胞免疫在抗結核感染的過程中發揮了重要作用。但是由于MTB的逃避機制，使得抗原不能順利呈遞，從而導致獲得性細胞免疫不能快速啟動，感染逐步形成[1]。而且，在感染MTB 的人群中發現，MTB 也能依靠microRNA（miRNA）激發對抗宿主細胞的免疫反應[4]。作為基因表達的調控因子，每個miRNA 都能調節數百個靶基因[5]，通過基因標記進行靶向調控；同時，由于miRNA 高甲基化與一些抑制免疫系統調控的基因甲基化密切相關，miRNA 也可以通過高甲基化來抑制免疫系統調控[6]。因此，檢測機體內細胞因子、miRNA 水平的變化，對了解結核病發展、轉歸及預防、診治有重要意義。本文就細胞因子、miRNA和結核感染之間的關系進行簡要綜述。

1 細胞因子

1.1 細胞因子的概念及生物學特征

細胞因子一般是相對分子質量為8×103～80×103的多肽或糖蛋白，其成熟分泌型分子所含氨基酸殘基多在200 個左右，不同細胞因子的氨基酸序列無明顯同源性（少數例外）。多數細胞因子以單體形式存在，少數以二聚體（如IL-5、IL-12、M-CSF、TGFβ）或三聚體（如TNF）形式存在。

大多數細胞因子以自分泌、旁分泌的形式發揮局部效應，在一定條件下，某些細胞因子也可以內分泌形式作用于遠端靶細胞，介導全身性反應。細胞因子須與靶細胞表面相應受體結合才能發揮其生物學效應，由于細胞因子及其受體間的親和力很高，故極微量（pmol/L 水平）即可發揮明顯的生物學效應。細胞因子的生物學效應很復雜，具有多效性、重疊性、拮抗性、協同性和雙向性特點。細胞因子的產生、生物學作用、受體表達、相互調節等均具有網絡性，它們之間可以相互誘生，形成相互正向或負向調節的網絡，而且，細胞因子可調節其受體的表達，其受體也可調節細胞因子的活性[7]。

1.2 細胞因子與結核感染

MTB 與宿主相互作用的研究顯示，MTB 感染始于MTB 的吸入，其病原體可被肺部的吞噬細胞破壞。吞噬細胞是清除致病微生物的重要效應細胞，它的生物學功能涉及定向遷移、識別、吞噬和殺菌等，它殺死MTB 的能力可通過細胞因子調節，Th1型細胞因子可增強其能力，Th2 型細胞因子可通過抑制Th1型細胞因子降低其能力[8-9]。有研究表明，Th1型和Th2 型細胞因子表達水平的相對高低，是誘導和維持MTB感染的重要因素[10]。

在機體抗MTB 感染的免疫防御中，T 淋巴細胞亞群比例及相關細胞因子被認為是決定細胞免疫強弱的主要因素。其中，Th1細胞主要產生Th1型細胞因子如IFN-γ、IL-2等，在胞內病毒和細菌感染的保護性免疫中起重要作用；Th2細胞主要產生Th2型細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13、IL-25等，對于清除胞外寄生蟲起關鍵作用[11]。在正常機體內，Th1/Th2 細胞處于相對平衡狀態，通過細胞因子相互交叉調節彼此的活性，一旦機體的免疫功能失常，這種平衡狀態就會被打破，從而引起結核病的發生和發展[12]。Th1/Th2 型細胞因子水平已成為結核病疫苗免疫原性評價的重要指標，有利于刺激Th1細胞反應和Th1型細胞因子分泌的疫苗才具有研究價值。另外，Th1/Th2 型細胞因子水平還能應用于結核感染的診斷，如IFN-γ釋放實驗（IFN-γ release assay，IGRA）就是近年出現的一種檢測MTB 感染的方法，它通過T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）診斷結核感染的發生，即以特異性抗原為刺激源，通過應用酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）來檢測外周血單核細胞（PBMC）中釋放的IFN-γ數量，以此判斷測試結果[13]。

1.3 與結核感染相關的主要細胞因子

1.3.1 IFN-γ IFN-γ即γ干擾素，是一種異型糖蛋白，主要由抗原和有絲分裂原等刺激活化的CD4+Th1 型、CD8+細胞和NK 細胞產生，通過與相應的受體結合，可發揮抗病毒、影響細胞生長分化、抗腫瘤及免疫調節等生物活性。它在抗MTB 感染免疫反應中起關鍵作用，通過促進T 細胞的增殖和分化，激活巨噬細胞，參與結核病的肉芽腫免疫反應等多方面發揮抗結核免疫作用。IFN-γ是機體發揮抗結核保護性免疫的重要細胞因子，通過檢測結核病人血清中的IFN-γ水平發現，結核組IFN-γ比對照組低，復治病例組比初治組低，這表明體內IFN-γ水平降低則機體保護性免疫力也降低，從而引起結核感染患者發病。

1.3.2 TNF-α TNF-α 即α 腫瘤壞死因子，它和IFN-γ均是Th1細胞分泌的特征性細胞因子，能夠增強巨噬細胞的殺菌作用，促進結核肉芽腫形成，同時它也是重要的促炎癥反應性細胞因子，與發熱、惡液質形成及結核病炎性反應程度相關。具有生物活性的TNF-α的產生與機體的免疫狀態以及所感染MTB 株的毒力有關，在防止感染部位擴散的過程中起關鍵作用。TNF-α水平適中對機體有免疫調節作用，過高則可對機體產生免疫損傷。

1.3.3 IL-4 IL-4 即白細胞介素4，主要由CD4+T淋巴細胞分泌，介導Th2 型免疫反應，目前多數研究認為它在結核免疫中主要起負性作用。有研究表明，在MTB 刺激的淋巴細胞內IL-4 促進CD30 的表達，使淋巴細胞對TNF 介導的細胞凋亡更加敏感。更有多項研究證明，未經治療的、病灶范圍大的、有空洞形成的患者血清中IL-4 水平顯著高于病灶范圍小的患者，存在Th1 反應（主要包括IFN-γ）減弱、Th2 反應（主要包括IL-4）增強現象[14]，而IL-4 基因突變或敲除小鼠較易導致肉芽腫的形成。

1.3.4 IL-6 IL-6 即白細胞介素6 是B 細胞刺激因子，由T 細胞和巨噬細胞、成纖維細胞、上皮細胞等產生，具有多重免疫調節功能，參與早期炎癥反應，在結核病人的外周血中濃度顯著升高[15]。MTB 感染中，IL-6 是分泌IFN-γ的T 細胞被激活所必需的細胞因子，而且它還是一種主要的誘導保護性T 細胞的因子，可加強IFN-γ的作用強度。

1.3.5 IL-10 IL-10 即白細胞介素10，主要由Th2細胞分泌，介導免疫抑制，抑制Th1 細胞應答，能夠阻斷巨噬細胞內MTB 吞噬體的成熟[16]。有研究表明，IL-10 能使慢性MTB 感染者肺內的MTB 快速大量復制，并降低抗MTB 感染中起保護作用的TNFα、IL-12 p40和抗原特異性IFN-γ的分泌[17]。與之相反，也有研究發現IL-10 能夠通過使樹突狀細胞轉化為類巨噬細胞來抑制MTB 的生長，因為后者對MTB有更強的吞噬作用。

1.3.6 IL-18 IL-18即白細胞介素18，是一種IFN-γ誘導因子，可刺激Th1 細胞產生IFN-γ，抑制IL-10的分泌。它也具有活化NK 細胞的作用，使T細胞向Th1 細胞功能極化發展，同時還可增加FasL 介導的細胞毒活性，在細胞免疫介導組織損傷中起重要作用。靶向破壞IL-18 基因會使感染MTB 的鼠體內IFN-γ水平下降，并出現明顯的肉芽腫反應，外源性IL-18能抑制此過程，且這種作用不能被其他的細胞因子所代替。有研究表明，結核病患者外周血中IL-18 表達明顯上調，且與肺部病變程度、臨床癥狀呈明顯相關性。此外，血循環中IL-18水平與IFN-γ水平也呈正相關。

1.3.7 IP-10 IP-10 即IFN-γ誘導蛋白10，是趨化因子CXC 亞家族的一種小分子趨化因子，在炎癥部位對淋巴細胞的活化和趨化起重要作用。病毒和細菌感染的細胞能夠分泌IP-10，細胞免疫過程中T 細胞分泌的IFN-γ和TNF-α能夠誘導IP-10的分泌，在IFN-γ或脂多糖的誘導下多細胞參與分泌IP-10，因此細胞免疫中IP-10 的濃度高于IFN-γ，顯著放大IFN-γ的信號功能[18]。有研究發現MTB 特異性肽融合抗原刺激肺結核患者的PBMC 能夠誘導產生高濃度的IP-10[19]，聯合檢測IP-10 能夠提高MTB 感染的IGRA 敏感性[20]。Lighter 等[21]發現，與IFN-γ相比，全血IP-10 含量沒有年齡依賴性，它對于兒童結核病的診斷價值大于IGRA。Farhat 等[22]發現并證實IP-10水平和LTBI 有較好的相關性；但Whittaker 等[23]的研究表明，在接受結核特異性抗原刺激前后，LTBI患者體內IP-10 水平均高于活動性肺結核患者，但兩者之間并無顯著差異，故IP-10 并不能區分LTBI和活動性肺結核。

2 miRNA

2.1 miRNA的概念及生物學功能

miRNA 是一類來源于內源性染色體上的非編碼單鏈調節RNA，長度約為22個核苷酸，以單拷貝、多拷貝或基因簇等形式存在于基因組中，且絕大部分定位于基因間隔區。它通過激活或抑制基因轉錄來調控基因表達，在機體的生理發育、疾病的發生和發展過程中發揮重要作用，可作為不同生理和病理狀態的分子標記[24]。miRNA 具有高度的保守性、時序表達特異性和組織表達特異性，值得一提的是特定的miRNA 表達在特定的細胞中，且這種組織特異性表達方式的miRNA約占50%。

2.2 miRNA與結核感染

MTB 感染后臨床表現多樣，分為LTBI、活動性肺結核和肺外結核病，其中較難診斷的是兒童肺結核和HIV 共患肺結核。為了提高診斷質量，發展基于宿主生理指標的診斷檢測技術已迫在眉睫[3,25]。考慮到miRNA 在基因表達中扮演的重要角色，它可能會作為有價值的生物指標來區分活動性肺結核和LTBI。研究表明，與正常人相比，LTBI 患者血清中的miR-130b*、miR-342-5p、miR-155、miR-181b、miR-548b-3p 表達下調[26]。Li 等發現，miR-146a 基因多態性通過調節TLR 信號通路強度進而調節對MTB 感染的易感性[27]；另有研究顯示，miR-146a 的表達水平在肺結核患者體內明顯低于正常對照組。這些均提示miR-146a 參與了肺結核的發生發展過程。

2.3 與細胞因子相關的miRNA

2.3.1 miR-29 體外和臨床研究顯示，人感染致病性分枝桿菌后miR-29會過表達[28]，它通過下調IFNγ水平來抑制宿主對MTB 的免疫反應[29]。此外，Ma等[30]篩選到了MTB感染后在Ⅱ型干擾素分泌型免疫細胞中顯著下調的miR-29。體外實驗證明，miR-29家族成員均可以直接靶向IFN-γ的3'非翻譯區，從而抑制其表達。表明miR-29 可以通過靶向IFN-γ的產生而調控抗細菌感染相關的免疫應答，為MTB防治提供了新的策略和潛在靶標。

2.3.2 miR-144* Liu 等[31]利用以寡核苷酸為基礎的芯片分析技術，在肺結核患者PBMC 中發現了28種上調的和2 種下調的miRNA，對上調的miR-144*進行功能分析發現其可以抑制IFN-γ和TNF-α的產生，從而抑制T 細胞的增殖。由于IFN-γ和TNF-α在保護性免疫反應中具有重要作用，所以miR-144*的過表達能影響結核病的發展。

2.3.3 miR-155 miR-155 已被確定是一個多功能的miRNA，它參與包括感染、炎癥和免疫的多個生物過程。有研究顯示，敲除miR-155 小鼠模型會導致IL-4 的表達上調而IFN-γ的表達下調，這表明在調節T 細胞依賴性反應中miR-155 有著非常重要的作用[32]。同時，miR-155 還能通過增強TNF mRNA的穩定性和半衰期來增加TNF的產生[33]。

2.3.4 miR-21 在體內或體外感染牛分枝桿菌卡介苗（BCG）后，非敏化的樹突狀細胞和巨噬細胞中miR-21 上調[34]，在MTB 的ESAT-6 抗原入侵巨噬細胞后miR-21也上調[35]。有研究表明，miR-21抑制促炎細胞因子的表達和促進抗炎細胞因子如IL-10 的產生[36]。miR-21 的抑制劑能誘導IL-12 的產生并引發更強的抗MTB 反應，同時它還能通過直接靶向IL-12 mRNA 的3'非翻譯區來抑制IL-12的表達，從而抑制宿主Th1反應。在MTB感染后它也能下調某些保護性細胞因子，如IL-6、TNF-α的表達，但這些細胞因子的水平在ESAT-6 暴露時變化不顯著。因此，miR-21可能是MTB用來逃脫宿主免疫反應和建立慢性感染的有效策略。

3 結語

MTB 感染人群數量龐大，目前對其早期的診斷尚無統一的金標準。近幾年來被廣泛研究的IGRA技術的診斷敏感性和特異性較其它方法有所提高，但在復雜的情況下診斷結果不理想，且花費高昂，對實驗室的要求也較高，難以普及。miRNA 作為新的標記物，在結核病診斷方面發展迅速，越來越多的關鍵miRNA 已被發現，其中個別miRNA 還能影響T 細胞的發育，如miR-29 可以通過直接靶向IFN-γ參與控制抗胞內菌感染相關的天然免疫和獲得性免疫，這為今后設計胞內菌防治方法提供了新策略[37]。相信通過研究感染MTB 患者體內miRNA和細胞因子的相互影響，能為更快速、更準確的MTB 診斷開辟新方向。

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