基因修飾的間充質干細胞臨床研究進展

孫輝 綜述，孫濤 審校

海軍總醫院 消化內科，北京 100048

20世紀70年代中期，Friedenstein 等第一次將大鼠骨髓來源的骨髓成祖細胞定義為間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）[1]。MSC 可來源于骨髓、脂肪、血、肺、臍帶、臍血、胎盤等組織，多項研究均表明在適宜環境下MSC 可分化成內胚層、中胚層，甚至外胚層細胞，具有向成骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌、軟骨細胞、平滑肌、肌腱細胞等中胚層細胞分化的能力，同時可以向外胚層的星形膠質細胞、神經元、血管內皮細胞、心肌細胞、胰島素分泌細胞等分化。其跨系、甚至跨胚層橫向分化的可塑性及強大的分化潛能使它適用于組織修復。MSC還可逃避免疫識別，抑制免疫反應，所以被稱為免疫原性細胞。因此，MSC 在細胞再生和免疫調節方面具有廣泛的應用前景。

1 基因修飾技術及修飾后MSC的優越性

基因修飾主要是指利用生物化學方法修改DNA 序列，將目的基因片段導入宿主細胞，或者將特定基因片段從基因組中刪除，從而達到改變宿主細胞基因型或使得原有基因型得到加強的作用。修飾基因一旦導入細胞，即可超表達特定基因或構建的基因，不斷合成特定蛋白質，使其對高血糖、激素濃度或藥物、化學因素等生理刺激反應更敏感。

相比其他成體干細胞（造血干細胞、神經干細胞等）而言，MSC 具有明顯的營養和免疫調節特性，更適用于治療退行性疾病。據報道，靜脈注射MSC 已成功治療移植物抗宿主病、成骨不全等多種系統性疾病，Wakitani 等發現已有多例使用MSC 治療軟骨不全的成功臨床案例[2]。原始或基因修飾的MSC 也可應用于肝臟、心肌、神經、骨、肌腱及其他結締組織的再生中。對于除器官移植再無其他治療方法的疾病，MSC 移植無疑讓患者看到了曙光。但原始MSC植入宿主后有存活時間短、損傷部位聚集濃度低等缺點，而基因修飾的MSC 能克服以上缺陷。通過優化干細胞和載體選擇，在MSC 內有效導入特定基因，并通過體外實驗驗證修飾后的MSC 表達蛋白的能力，將其應用于臨床，可治療獲得性和遺傳性疾病。

2 基因修飾的MSC的臨床應用

2.1 人工肝

據研究，在分離培養的早期肝細胞中加入曲古柳菌素A（trichostatin A，TSA）后可阻斷細胞周期的G0/G1，以維持肝細胞功能[3]。因此，在人MSC（hMSC）內預先注入1μL TSA，并用肝源刺激因子預處理6 d，即可分化成顯型且功能特點與原始肝細胞類似的細胞[4]，特別是當加入基因調節劑組蛋白去乙酰化酶抑制劑時，就可促進肝源祖細胞分化成全能肝細胞。一般情況下，基因調節劑可影響細胞進程的多個階段（細胞周期、分化、凋亡等），因此，通過基因修飾可有效培養早期肝細胞。鑒于以上原理和事實，基因修飾對基因表達和細胞命運至關重要，在此過程中，導入時機、計量和環境條件是主要影響因素[5]。

2.2 糖尿病

胰腺移植是目前治愈1 型糖尿病的惟一方法，胰腺供體的匱乏，大大促進了細胞替代療法的發展。MSC 的組織再生和免疫調節特性，可促進血管生成、胰腺β細胞再生和避免移植排斥反應，結合現已取得的基因療法的研究成果，基因修飾后的MSC進一步發揮原始MSC 的治療優勢，重獲干細胞樣特性。通過基因修飾或改變培養環境，來源于胰腺、骨髓、脂肪、臍帶等組織的MSC 有分化成胰島素分泌細胞（insulin-producing cells，IPC）的潛能，因此MSC為胰島移植提供了另一種β細胞的來源。Li 等[6]在體外實驗中，通過腺病毒載體轉導Pdx1（pancreatic duodenum homeobox protein-1）到hMSC 內，可誘導其分化成功能性IPC，還可表達多種胰島細胞基因（neurogenin 3 因子、胰島素、半乳糖激酶、胰高血糖素），在葡萄糖調節模式中釋放胰島素或C 肽。在動物實驗中，移植Pdx1 基因修飾的hMSC 到鏈脲菌素誘導的糖尿病小鼠模型，可促進胰島再生，2 周內小鼠血糖就可達到正常水平，并維持至少42 d，并在受體腎小囊內發現了可表達胰島素的移植細胞。因此，基因修飾的hMSC可作為治療糖尿病的新方法。

2.3 心梗

近十年，關于MSC 的研究越來越多，尤其在心梗的治療中，MSC的可塑性、歸巢和炎性調節特性對因動脈堵塞引起的心肌缺血損傷有良好的修復作用。基因修飾的MSC 可促進內皮細胞分化和血管生成，并分泌更多的生長因子以修復心肌功能，通過基因修飾加強營養因子、細胞活素或其受體的表達，可使其在梗死心肌有效存活、歸巢和動員。MSC 超表達的CXCR4 與其配體SDF-1 結合后可增強移植和再生能力，并促進心肌壁的血管生成，降低膠原Ⅰ/Ⅲ比率以減少重塑[7-8]。類似地，SDF-1 超表達的MSC可保護受體心肌細胞并提供營養支持。相比于原始MSC 移植，超表達CXCR-4和SDF-1 的MSC 在治療冠脈閉塞再灌注損傷小鼠時有更強的遷移、局限和治療作用。據Noiseux 等的研究[9]，用綠色熒光蛋白（GFP）標記的Akt 超表達的鼠MSC 注入心梗模型鼠梗死區域后，追蹤標記的GFP 早達3 d 就出現MSC 與受體心肌細胞融合的現象。據此，可見MSC是目前心梗治療的新希望。

2.4 腦卒中

細胞替代療法是治療神經系統疾病的新選擇，Kim 等[10]發現Ngn1 可誘導MSC 分化成神經元，分化的細胞可表達電壓門控L-型鈣通道和河豚毒素敏感型電壓門控鈉通道，這2 條通道可激發并傳播神經元。Ngn1 基因修飾的MSC 移植入腦卒中大鼠模型顱骨內后可促進神經元間接觸，提高傳導功能。研究還發現人端粒酶逆轉錄酶修飾hMSC 可用于大鼠腦缺血模型的功能恢復[11]，修飾后的hMSC 由靜脈注入中腦動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的大鼠模型，12 h后觀察發現腦梗死面積明顯減少，且鼠臨床表現也明顯改善。MSC 還可通過分泌如腦衍生神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）這類神經調節分子，促進神經細胞存活和神經形成[12]。為進一步增強其旁分泌作用，Kurozumi等[13]通過腺病毒載體將BDNF基因整合到hMSC 中，觀察發現BDNF 的分泌量是未進行基因整合的MSC 的23 倍。目前的研究結果均說明通過不同方式修飾的MSC 作為一種治療腦卒中的新方法，可減少梗死面積并促進腦缺血的功能恢復。

2.5 帕金森病

帕金森病主要的病理改變是中腦黑質多巴胺（dopamine，DA）能神經元的變性死亡，由此而引起紋狀體DA 含量顯著性減少而致病。而MSC 在一定誘導條件下可分化成神經細胞，基因修飾的MSC 更可持續翻譯出治療性蛋白，用于治療神經退化性疾病。早期Schwarz 等[14]通過體內外實驗均驗證了基因修飾的MSC 治療6-羥基多巴胺誘導的帕金森模型鼠的有效性，通過逆轉錄病毒轉導酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）基因到MSC內，翻譯的TH可使酪氨酸轉變成L-多巴，且在鼠紋狀體內檢測到了L-多巴及其代謝產物。以上研究均表明基因修飾的MSC是治療帕金森病的最優細胞治療方案。

2.6 骨骼、肌肉系統疾病

轉化生長因子β（TGF-β）超家族成員骨形態發生蛋白（BMP）修飾的MSC在形成骨和軟骨過程中發揮重要作用。在骨缺陷的動物實驗[15]及脛骨骨折不愈、脊柱融合術和骨不連的臨床試驗[16]中，均證明了BMP-2 的成骨作用。基因修飾的MSC 不僅可分化成肌肉骨骼細胞，還可刺激臨近細胞參與修復，移植MSC到重度免疫聯合缺陷的小鼠模型的脛前肌或關節中，短期表達BMP-2 就可有效誘導骨軟骨形成。結合基因的治療作用更優于整合基因，BMP-2/7和BMP-4/7 異二聚體比同型二聚體有更好的活性，同時轉導BMP-2 或BMP-4和BMP-7 進入MSC 的成骨作用是簡單基因整合的2～3 倍[17-18]。有研究發現，通過調節過表達成骨轉錄因子Runx2可控制MSC的成骨分化[19]，這能夠避免由BMP 過表達引起的異常成骨。基因修飾MSC 是骨軟骨疾病的新型治療方法，且通過調節表達系統可防止成骨的過表達。

2.7 癌癥

基因修飾的MSC 可在腫瘤靶向治療中發揮抗腫瘤作用，在癌癥治療方面有不可預期的前景。研究提出γ干擾素（IFN-β）通過抑制增生、促進凋亡起抗癌作用，但IFN-β的抗腫瘤濃度高于人體可耐受的最大劑量，而導致實驗失敗。為解決此問題，Studeny 等[20-21]通過靜脈注射表達IFN-β的MSC 到重度免疫聯合缺陷小鼠體內，治療肺多發轉移腫瘤，可見MSC 定位于肺腫瘤組織，抑制肺代謝并延長小鼠生存時間。Xin 等[22]研究表明，CX3CL1 超表達的MSC 也可起相同的作用。Nakamizo 等[23]進一步研究了表達IFN-β的MSC治療顱內神經膠質瘤裸鼠的方案，發現MSC 定位于神經膠質瘤部位，亦明顯延長小鼠存活時間。在Stagg 等[24]的類似研究中，探索了表達白細胞介素2（IL-2）的MSC 能否抑制免疫系統正常的低免疫原性B16 黑色素瘤小鼠的免疫反應，結果表明，表達IL-2 的MSC 與B16 細胞混合后可抑制腫瘤增生，且抑制作用與IL-2 的劑量成正比，對腫瘤的抑制率達90%，有效抑制B16 細胞的增生；但移植原始MSC 的對照組不影響腫瘤生長。通過不同方式的基因修飾均可達到治療癌癥的目的。

3 結語

臨床上的持久難愈疾病及不斷出現的新危險因素都給病人及醫生帶來巨大挑戰，尋找新的治療方法刻不容緩。基因修飾的MSC 在臨床疾病治療中有多潛能作用，通過合適的修飾，增強基因表達，使移植后的干細胞在宿主環境中可以存活更久，并分泌對病人有利的特定蛋白，起到治療疾病的目的。但將細胞替代療法應用于臨床實踐是一個巨大的挑戰，目前迫切要解決的問題是如何精確地改良干細胞，翻譯出特定蛋白質，有效用于疾病治療。

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