利用醬油廢水生產(chǎn)微生物絮凝劑及其絮凝條件優(yōu)化

李瑤瑤，彭登科，董新姣

(溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 溫州325035)

0 引言

微生物絮凝劑(MBF)，是由微生物產(chǎn)生的可使液體中不易沉降的固體懸浮顆粒、菌體細胞及膠體顆粒等凝聚沉淀的特殊高分子物質(zhì)，主要成分有糖蛋白、胞外多糖、蛋白質(zhì)、纖維素和核酸等。微生物絮凝劑具有易生物降解，適用范圍廣，熱穩(wěn)定性強，用量小，無二次污染等優(yōu)點，與傳統(tǒng)的無機與有機高分子絮凝劑相比具有更廣泛的應用前景。由于MBF不僅克服了無機和有機絮凝劑在使用安全和環(huán)境污染方面的問題，且易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，所以MBF取代大部分傳統(tǒng)的無機高分子和合成有機高分子絮凝劑將成為一種趨勢［1～5］。但微生物絮凝劑目前存在生產(chǎn)條件較復雜、成本偏高等不足之處，其研究尚處于實驗室階段。如何降低微生物絮凝劑成本，成為當今研究的熱點。國內(nèi)外學者也曾利用淀粉廢水、味精廢水和豆制品廢水作為廉價替代培養(yǎng)基進行微生物絮凝菌的培養(yǎng)，但研究報道還不多［6～8］。

本研究以高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌WN-2為研究對象，采用醬油廢水為培養(yǎng)基，利用高嶺土懸浮液對所產(chǎn)微生物絮凝劑進行絮凝率測定，考察了各種條件如外加碳源、氮源、無機鹽、培養(yǎng)時間、pH值等因素對絮凝率的影響，優(yōu)化了培養(yǎng)條件，以期為高效微生物的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌由本實驗室從溫州調(diào)味品有限公司活性污泥分離、篩選得到。

1.1.2 培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖20.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，磷酸氫二鉀5.0 g，硫酸銨0.2 g，氯化鈉0.1 g，尿素0.5 g，酵母膏0.5 g，硫酸鎂0.2 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.5～8.5。

保藏培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH =7.0～7.2。

醬油廢水培養(yǎng)基取自海螺集團生產(chǎn)醬油后所產(chǎn)生的醬油廢水。COD值為89 398.72 mg/L，NHN為90.2 mg/L，TN為102.8 mg/L，TP為3.7 mg/L，pH=5.27，其為車間的沖冼水和生產(chǎn)老抽時產(chǎn)生的廢糖蜜水混合在一起，主要成分為多糖，因此COD含量高。經(jīng)抽濾后，用于菌株的廉價培養(yǎng)。

1.1.3 高嶺土懸濁液 在100 mL量筒中加入80 mL蒸餾水，0.4 g高嶺土(化學純，平均粒度4.5 μm)，5 mL 1%CaCl2溶液，2 mL上清液待測樣品，再加蒸餾水至100 mL，制成4 g/L的高嶺土懸濁液(每次測定絮凝率時當場配制)。

1.2 方法

1.2.1 絮凝率的測定 絮凝效果用絮凝率來表征。在100 mL量筒中加入80 mL蒸餾水，0.4 g高嶺土(化學純，平均粒度4.5 μm)，5 mL 1% CaCl2溶液，2 mL上清液待測樣品(取0.5 mL接種到50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃，160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72 h后，將所得的培養(yǎng)液在10 000 r/min下離心15 min，得上清液)，再加蒸餾水至100 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0，然后倒入150 mL燒杯，放在磁力攪拌器上快速攪拌1 min，慢速攪拌3 min，靜置10 min，以吸管吸取一定深度的上清液于紫外可見分光光度計550 nm處測定吸光度，同時以不加含絮凝劑的上清液作對照實驗并用以下公式計算其絮凝率:

式中，A為對照上清液在550 nm處的吸光度，B為樣品上清液在550 nm處的吸光度。

1.2.2 不同廢水濃度對絮凝率的影響 將醬油廢水稀釋為原水的1/2、1/4、1/8后，將WN-2菌投入到培養(yǎng)基中，置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測定其絮凝率和COD，考察不同廢水濃度對絮凝率的影響。

1.2.3 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗 采用單因素優(yōu)化實驗，分別外加碳源、氮源、無機鹽、改變培養(yǎng)基中初始pH、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度選出絮凝菌在各種單因子改變時最優(yōu)條件。

不同外加碳源:分別加入各種碳源、葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖，質(zhì)量濃度為2 g/L，接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測定其絮凝率，考察不同外加碳源對絮凝率的影響。

不同外加氮源:分別加入各種氮源、硝酸鉀、氯化銨、牛肉膏、蛋白胨，質(zhì)量濃度為3 g/L，接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測定其絮凝率，考察不同外加氮源對絮凝率的影響。

不同外加無機鹽:分別加入各種無機鹽、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鈣，質(zhì)量濃度為0.2 g/L，接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測其絮凝率，考察不同外加無機鹽對絮凝率的影響。

初始pH的選擇:pH值分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測定其絮凝率，考察不同培養(yǎng)基初始pH值對絮凝率的影響。

培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的選擇:調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速分別為120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min，接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測定其絮凝率，考察不同搖床轉(zhuǎn)速對絮凝率的影響。

培養(yǎng)時間的選擇:接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h后，測定絮凝率，考察不同培養(yǎng)時間對絮凝率的影響，確定最佳培養(yǎng)時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同廢水濃度對絮凝率的影響

將醬油廢水進行不同濃度稀釋，考察不同廢水濃度對絮凝率的影響其結(jié)果見表1。

表1 醬油廢水濃度對絮凝率的影響

由表1可見，最合適的配方為將醬油廢水稀釋為原來的1/4。醬油廢水本身的COD濃度太高，如原水的樣品和將原水稀釋為1/2的樣品，絮凝率分別為0%和43.90%。這是因為由于COD太高時，微生物的生長受一定的抑制，而且培養(yǎng)基的濃度過高，廢水中的雜質(zhì)也影響絮凝效果;但將醬油廢水稀釋為原來的1/8時，因為COD的濃度太低，此時培養(yǎng)基中的碳源不足，菌生長量僅為4 031 mg/L，影響絮凝效果，絮凝率僅為48.91%。最合適的配方為將醬油廢水稀釋為原來的1/4，此時培養(yǎng)基的COD為23148 mg/L，絮凝率為77.44%，相比前2種廢水，由于其營養(yǎng)豐富，只需原液濃度的1/4，即可滿足菌生長的要求。而醬油廢水中COD之所以高，是因為車間的沖冼水和生產(chǎn)老抽時產(chǎn)生的廢糖蜜水混合在一起，主要成分為多糖，因此COD含量高。其中COD的測定重鉻酸鉀法。

2.2 絮凝劑產(chǎn)生菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗

2.2.1 不同外加碳源對絮凝率的影響 不同外加碳源對絮凝率的影響，結(jié)果如表2。

表2 不同碳源對絮凝率的影響

由表2可知，沒有外加碳源，直接利用醬油廢水作為培養(yǎng)基時，絮凝率為82.0%，加入葡萄糖，蔗糖和果糖均能促進絮凝劑產(chǎn)生菌菌體生長和絮凝劑合成，加入葡萄糖時的絮凝率最高，絮凝率為84.3%。但綜合總體數(shù)據(jù)看，外加碳源后，對絮凝率的提高不明顯，可能的原因是醬油廢水含有豐富的碳源，其中碳源的量足以滿足菌株的生長，因此可不必外加碳源。

2.2.2 不同外加氮源對絮凝率的影響 不同外加氮源對絮凝率的影響，結(jié)果見表3。

表3 不同氮源對絮凝率的影響

由表3可知，在沒有外加氮源的情況下，絮凝率為82.0%;外加硝酸鉀、氯化銨、牛肉膏、蛋白胨，絮凝率分別為82.1%、78.3%、83.1%、82.8%。從絮凝率來看，各種外加氮源條件下對絮凝率的提高不大，由此說明該醬油廢水含有較多的氮源，已滿足菌株的生長需求，可不必外加氮源。

2.2.3 不同外加無機鹽對絮凝率的影響 不同外加無機鹽對絮凝率的影響，結(jié)果見表4。

由表4可知，在不外加無機鹽的時絮凝率為82.0%，外加磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鈣時，絮凝率分別為83.4%、81.3%、84.2%、87.1%，說明外加無機鹽對醬油廢水的絮凝率都有所增加，且在添加氯化鈣的情況下，對醬油廢水的絮凝率增加較多。

2.2.4 不同培養(yǎng)基初始pH值對絮凝率的影響pH值對微生物的生長和代謝具有很大的影響，太高或太低的pH值都不利于細菌的生長和絮凝劑的產(chǎn)生。一方面pH值過低或過高都會引起微生物表面電荷的改變，從而不利于細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收;另一方面過高或過低的pH值使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶電荷發(fā)生變化，從而影響其生物活性。不同培養(yǎng)基初始pH值對絮凝率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，初始pH為6.0～8.0范圍內(nèi)具有較高的絮凝率，pH為7.0時最高絮凝率達81.1%。

圖1 不同初始pH對絮凝率的影響

2.2.5 不同培養(yǎng)溫度對絮凝率的影響 不同培養(yǎng)溫度對絮凝率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當培養(yǎng)溫度小于30℃時，WN-2菌所產(chǎn)絮凝劑的絮凝率隨溫度的升高而增強，當培養(yǎng)溫度30℃時絮凝率最高，絮凝率為80.2%。繼續(xù)升高培養(yǎng)溫度，絮凝率隨溫度升高而下降。這是由于微生物生命活動和物質(zhì)代謝都與溫度密切相關(guān)，溫度過高或過低都會影響細胞內(nèi)酶的活性，從而影響絮凝劑的絮凝率。

圖2 不同溫度對絮凝率的影響

2.2.6 不同搖床轉(zhuǎn)速對絮凝率的影響 不同搖床轉(zhuǎn)速對絮凝率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，搖床轉(zhuǎn)速在整個范圍內(nèi)對絮凝率影響并不大，當搖床轉(zhuǎn)速小于160 r/min時，隨著搖床轉(zhuǎn)速增加絮凝率增大，當轉(zhuǎn)速達到160 r/min之后，絮凝率趨緩而下降，但仍具有較高的絮凝率，最佳搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

圖3 轉(zhuǎn)速對絮凝率的影響

2.2.7 不同培養(yǎng)時間對絮凝率的影響 微生物絮凝劑的生產(chǎn)與菌株培養(yǎng)時間有密切關(guān)系，不同培養(yǎng)時間下，菌株表現(xiàn)出不同的絮凝率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，WN-2在培養(yǎng)時間36 h達到最高絮凝率80.6%。在剛接種到發(fā)酵培養(yǎng)液的一段時間內(nèi)，由于菌株由生長的遲緩期到對數(shù)期，其生長代謝逐漸旺盛，絮凝率也隨之提高，WN-2在培養(yǎng)時間24 h后，絮凝率趨于平緩并開始下降，可能是由于體系中解絮凝率酶的產(chǎn)生或生長后期營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡所致［9］。

圖4 培養(yǎng)時間對絮凝率的影響

2.2.8 最佳培養(yǎng)條件下的絮凝率 將以上單因素實驗所獲得WN-2菌株的最佳絮凝條件進行組合，在最佳條件下將WN-2菌接入醬油廢水培養(yǎng)基內(nèi)并對高嶺土懸濁液進行絮凝實驗，測得其絮凝率為93.6%，由此可見，在最佳的絮凝條件下，菌株WN-2具有較強的絮凝能力。

表5 微生物產(chǎn)絮凝劑的最優(yōu)培養(yǎng)條件

3 結(jié)論

(1)通過單因素條件試驗得出WN-2對高嶺土懸濁液的最佳絮凝條件為:最佳外加無機鹽為氯化鈣，濃度為0.2 g/L;最佳培養(yǎng)時間為36 h;最佳pH為7.0;最佳培養(yǎng)溫度為30℃;最佳搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。在最佳培養(yǎng)條件下，測得其絮凝率為93.6%。

(2)醬油廢水中，外加氮源和外加碳源對微生物產(chǎn)絮凝劑的絮凝率影響均不大，表明該廢水中含有較為豐富的碳源和氮源，可以滿足微生物的生長需求，實驗結(jié)果表明利用醬油廢水作為替代培養(yǎng)基可以實行廢物的資源化利用。

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