白色念珠菌耐藥相關UPC2基因的研究進展

張曉云，馬巧玲，姜利群

（中國人民解放軍第184醫院檢驗科，江西 鷹潭 335000）

白色念珠菌耐藥相關UPC2基因的研究進展

張曉云，馬巧玲，姜利群

（中國人民解放軍第184醫院檢驗科，江西 鷹潭 335000）

本文綜述了白色念珠菌對唑類抗真菌藥物的耐藥機制、UPC2基因結構特征、UPC2基因編碼產物的功能，指出白色念珠菌UPC2基因編碼產物能對ERG基因以及某些藥物外排泵蛋白基因表達發揮調節作用，從而誘導白色念珠菌對唑類藥物產生耐藥性。

白色念珠菌；UPC2基因；氟康唑；耐藥

白色念珠菌(Candida albicans)是一種常見條件致病菌，通常存在于正常人皮膚、口腔、上呼吸道、腸道及陰道等黏膜部位[1]。患者處于機體免疫力下降、介入性治療等情況下，白色念珠菌可侵襲機體，引起院內機會性感染[2]。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的濫用、器官移植免疫抑制劑應用、放化療增多、各種生物裝置體內置入和導管留置等，使得免疫功能低下者不斷增多，白色念珠菌引起的醫院內獲得性感染呈增多趨勢，已成為此類患者死亡的主要原因。國內學者報道，臨床真菌感染患者中白色念珠菌感染占67.54%[3]。氟康唑、伏立康唑等唑類藥物抗真菌譜廣、毒性低、半衰期長[4]，臨床上被廣泛用于防治真菌感染。在藥物選擇性壓力下，臨床分離的白色念珠菌對常用抗真菌藥物產生了一定耐藥性，導致藥物效能降低乃至失效，給臨床用藥安全帶來了巨大挑戰[5]。

1 唑類藥物的作用靶點以及抗菌機制

膽固醇是高等生物細胞膜的重要組分，為細胞膜發揮功能所必需。麥角固醇是膽固醇的同功異構物，存在于真菌等真核細胞的細胞膜上，是此類細胞膜發揮功能所必需的固醇物質之一。白色念珠菌細胞膜上含有麥角固醇，是白色念珠菌生長所必須的組分。白色念珠菌細胞合成麥角固醇時，細胞色素p450復合體中的14α-羊毛固醇去甲基酶(Erg11p)是關鍵限速酶。Erg11p由白色念珠菌的ERG11基因(又名CYP51基因)編碼[6]。一旦Erg11p酶活性受到干擾，細胞合成的麥角固醇減少，一方面導致膽固醇合成途徑中的有毒中間體物質增加，另一方面造成細胞膜流動性以及細胞膜蛋白(例如參與細胞壁合成的酶以及轉運蛋白等)活性發生改變，真菌細胞生長受到抑制乃至死亡[4]。唑類抗真菌藥物的作用靶酶是Erg11p[7]。唑類抗真菌藥與Erg11p的血紅素鐵活性中心結合后，Erg11p酶活性受抑，麥角固醇合成被抑制或阻斷，引起真菌細胞作用生長受抑或死亡。

2 真菌對唑類藥物的耐藥機制

白色念珠菌對唑類抗真菌藥物的耐藥機制主要如下：①藥物作用靶酶(主要是Erg11p酶)基因突變或過度表達[8]，使得Erg11p酶活性未受明顯影響，真菌細胞的麥角固醇合成繼續維持，真菌繼續生長。②藥物外排泵基因表達上調，使得真菌細胞對藥物的主動外排能力增強，減少了藥物在真菌細胞內的累積[9]，真菌得以繼續生長。白色念珠菌通過主動耗能方式將氟康唑從細胞內排出到細胞外，白色念珠菌多個基因表達產物參與了對藥物的主動外排。白色念珠菌藥物外排相關的泵蛋白主要包括兩類[9]，一類是Abc轉運蛋白，由CDR基因編碼，含有ATP結合區；另一類是易化子家族蛋白，由MDR基因編碼。白色念珠菌對藥物的敏感性與藥物外排泵蛋白基因表達水平有關。泵蛋白表達水平主要受到兩類基因的影響：一類是藥物外排泵蛋白編碼基因，編碼跨膜轉運蛋白，這些蛋白負責將藥物從細胞內排出到細胞外；另一類是轉錄因子編碼基因，編碼轉錄因子，對上述泵蛋白的編碼基因表達發揮調節作用，直接影響泵蛋白表達水平，從而影響藥物敏感性。

3 UPC2基因在真菌對唑類藥物耐藥中的作用

3.1 UPC2基因結構特征白色念珠菌UPC2基因屬于一種轉錄因子編碼基因，編碼產物為Upc2蛋白(Upc2 protein，Upc2p)。Upc2p為一種轉錄調節因子，屬于鋅簇家族轉錄因子成員，含有2個鋅離子和6個半胱氨酸殘基，對白色念珠菌的多個基因表達具有調節作用轉錄調節功能[10]，如調節ERG11基因轉錄與表達。鋅簇家族轉錄因子的其他成員參與調節白色念珠菌的其他新陳代謝活動，例如CAP1轉錄因子調節真菌細胞應對氧化應激壓力，GAT1轉錄因子調節氮元素代謝，CPH1、EFG1、TUP1等轉錄因子參與調節菌絲形態轉換[11]。UPC2基因5'端的啟動子區域存在兩個結構域：ATG上游的-450～-350 bp區域為UDR(Upc2p-dependent region)，ATG上游的-350～-250 bp區域為UIR(Upc2p-independent region)。UPC2基因啟動子中的這兩個元件都能夠結合Upc2p，因此，UPC2基因表達水平受到順式作用調節。接受轉錄因子Upc2p調節的靶基因的啟動子區域帶有固醇反應元件(Sterol response element，SRE)。SRE含有7 bp的保守核心序列，正義鏈為5'-TCGTATA-3'，反義鏈為5'-TATACGA-3'。體外實驗表明，Upc2p帶有DNA結合區域，能夠與靶基因的SRE直接結合，從而激活靶基因，上調靶基因表達。真菌某些對唑類藥物耐藥基因也帶有SRE元件，接受Upc2p的轉錄調節[12]。

3.2 UPC2基因編碼產物Upc2p的功能Upc2p參與白色念珠菌對唑類藥物耐藥主要與兩方面因素有關：第一，Upc2p是真菌細胞膜麥角固醇合成的關鍵調節因子；第二，Upc2p通過調節藥物外排泵基因的表達水平來影響菌株對藥物的敏感性。

3.2.1 野生型Upc2p上調ERG11基因表達在白色念珠菌臨床耐藥株的中，ERG11基因過度表達引起藥物靶酶Erg11p蛋白增加，是唑類藥物敏感性下降的主要原因。ERG11基因表達水平高低與Upc2p活性和ERG11基因突變有關[13]。在氟康唑耐藥的白色念珠菌中，ERG11基因產物增多，氟康唑無法阻止全部的酶活性，白色念珠菌繼續合成麥角固醇，得到存活。由于Upc2p能夠直接激活ERG11基因以及多個參與麥角固醇合成的ERG基因的轉錄與表達，因此白色念珠菌對唑類藥物耐藥與Upc2p活性改變密切相關。UPC2基因表達水平變化以及基因突變是Upc2p活性的重要影響因素。在氟康唑耐藥的臨床白色念珠菌中發現，UPC2基因、ERG11基因以及參與麥角固醇合成的其他基因表達均發生了上調，證實UPC2基因過度表達后激活ERG11基因表達，導致細胞內Erg11p酶增加，引起白色念珠菌對唑類藥物耐藥。

3.2.2 突變型Upc2p上調ERG11基因表達白色念珠菌UPC2基因發生有義突變后引起ERG11基因表達上調，導致菌株產生耐藥性[14]。研究發現，白色念珠菌Upc2p的C末端是重要的功能區，是基因突變的熱點地區，UPC2基因易發生G648D或A643T突變[15]，兩種突變均會引起真菌對唑類藥物耐藥。將G648D突變型UPC2基因引入敏感株，突變型Upc2p活性增強，造成突變菌株ERG11基因持續性表達上調，白色念珠菌對氟康唑呈現耐藥性。另有研究指出，白色念珠菌臨床耐藥株的UPC2基因發生了A643V突變。A643V突變型白色念珠菌的氟康唑MIC提高了兩倍，麥角固醇含量高于野生型菌株。QRT-PCR表明，突變型菌株的UPC2基因以及ERG2、3、5、6、9、10、11基因的mRNA水平均高于野生型。值得注意的是突變型菌株的ERG1基因的mRNA水平低于野生型。這些結果提示：UPC2基因的點突變，除了自身具有順式調節作用外，還發揮反式調節作用，調節其他ERG基因的轉錄[13]。

3.2.3 Upc2p調節藥物外排泵基因表達在白色念珠菌臨床耐藥株中還觀察到，TAC1、MRR1等轉錄因子發生功能性突變后會導致CDR1、MDR1等藥物外排泵蛋白過度表達，繼而引起菌株產生多重耐藥性[16]。這也提醒我們，Upc2p可能也具有類似功能，通過轉錄調節某些藥物外排泵蛋白的表達，而誘導真菌對某些藥物產生多重耐藥性。另外，在白色念珠菌臨床耐藥株中還發現，氟康唑類藥物的靶標酶的編碼基因ERG基因發生點突變，也會引起ERG基因過度表達，從而使菌株產生耐藥。臨床研究已發現，Erg11p有60多種突變型，其中的Y132H、G450E、G464S、R467K和S405F突變型與氟康唑和伏立康唑的敏感性有關，與泊沙康唑敏感性無關[17]。

綜上所述，白色念珠菌UPC2基因編碼的Upc2p是一種重要的轉錄因子，能對ERG基因以及某些藥物外排泵蛋白基因表達發揮調節作用，從而誘導白色念珠菌對唑類藥物產生耐藥性。

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10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.1001

2014-03-25)

南京軍區醫學科技創新項目（編號：12MA050）

張曉云。E-mail：zhangxy167@163.com