精子DNA碎片與輔助生殖結局關系的研究進展

王志強，楊 杰(綜述)，倪亞莉，柴三明(審校)(甘肅省婦幼保健院生殖醫學中心，甘肅 蘭州 730050)

·綜述·

精子DNA碎片與輔助生殖結局關系的研究進展

王志強，楊 杰(綜述)，倪亞莉，柴三明*(審校)
(甘肅省婦幼保健院生殖醫學中心，甘肅 蘭州 730050)

生殖技術，輔助；活性氧；精子DNA碎片

我國不孕癥患病率大約為10%～15%，而在眾多的不孕原因中，男方因素所致不孕可達40%。約10%正常男性以及20%～25%不育男性都有較嚴重的精子DNA損害[1]。精子DNA損傷可能會對精子的正常受精能力以及受精以后的胚胎發育過程產生影響，并通過人類輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)造成醫源性的傳播。對于男性不育患者，尤其是嚴重少弱精和非阻塞性無精癥患者，如何通過ART技術降低可能因精子DNA異常所致的不良妊娠事件和新生兒出生缺陷的發生率，改善妊娠結局，是生殖醫學發展亟待解決的難題。現就精子DNA碎片研究進展及其與輔助生殖結局的關系綜述如下。

1 精子DNA碎片產生機制

精子是一種具有特殊形態的高度分化細胞，其特定的形態在一定程度上可以保護精子DNA免受外界毒物的損傷。精子DNA碎片的形成主要由其內部因素所致，形成機制包括：①精子染色質組裝缺陷、內源性核酸酶(拓撲異構酶Ⅱ)異常；②凋亡異常；③氧化應激是產生精子DNA碎片的主要原因，同時非整倍體也可以引發精子DNA碎片的產生，疾病、高熱、睪丸局部溫度增高、環境毒物、吸煙、藥物和年齡等原因也可能造成精子DNA 的損傷。

1.1 活性氧對精子DNA的損傷：精液中活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生過多或消除減少，都會導致精子ROS高于正常水平。形態或功能異常的精子、精液中白細胞的異常聚集、陰囊溫度過高、精索靜脈曲張、年齡增長以及吸煙等不良嗜好都可使精子ROS水平上升[2]。同時，當機體自身的抗氧化能力出現異常而不能及時清除過多的ROS時，也會使精子ROS超過正常水平。活性氧可參與精子的超活化、精子獲能、頂體反應以及其他一些生育相關的分子生物學過程。生理狀況下，精子內部ROS始終維持在相對穩定的水平，當精子ROS水平超出了精子的抗氧化防御系統導致精子處于氧化應激狀態時，不僅會影響精子的正常受精能力，同時還會對受精以后的胚胎發育過程產生影響。

精子內部含有豐富的多元不飽和脂肪酸，精子DNA的損傷修復能力相對有限以及精子抗氧化能力相對較弱，這使得精子更容易受到高水平ROS的影響。ROS對精子的損傷作用主要是通過引起脂質過氧化、損傷精漿蛋白和DNA來體現的；此外，精子線粒體作為產生ROS的細胞器，當細胞內ROS達到一定水平之后，也會受到ROS的損傷，大量線粒體被破壞，由于能量的缺乏，可使精子活力明顯下降[3]。精子DNA完整性與妊娠過程密切相關，DNA發生氧化損傷的精子依然有能力與卵母細胞結合受精，但是損傷的DNA一旦整合到胚胎基因，它將可能導致發育過程中的胚胎DNA在復制、轉錄和翻譯時發生錯誤，從而引起各類不良妊娠結局[3-4]。

1.2 精子DNA碎片與蛋白組學改變：正常成年男性一次射出的精液包含多種細胞成分和不同發育階段的精子。含有大量精子DNA碎片的精液中，其精子蛋白組學可能會發生改變。①碎片基因的翻譯錯誤，因為精子蛋白的轉錄和翻譯過程在精子形成之前一直處于十分活躍的狀態，錯誤的DNA信息可通過轉錄和翻譯過程傳遞給新合成的蛋白[5]。②在精子的儲存、成熟和運輸過程中，附睪液與精子膜蛋白之間以主動轉運為基礎的蛋白交換也可引起精子蛋白組學的改變。正常狀況下，附睪液和精子膜蛋白之間存在大量的蛋白交換，精子細胞膜通過不斷向內主動轉運附睪分泌蛋白的同時，也會移除特定的睪丸蛋白。魚精蛋白是含量最為豐富的精子核蛋白，但其具體的作用機制尚不明確，生殖醫學研究對其生理作用作出了3種可能的推測，即濃縮精子細胞核、保護父系基因免受核酸酶和自由基的損傷以及基因印記。帶正電荷的魚精蛋白可以通過與帶負電荷的精子DNA結合，形成緊密的DNA-魚精蛋白復合體，因此，當精子蛋白組學發生改變致使魚精蛋白缺乏或形成的DNA-魚精蛋白復合體受損時，增加DNA碎片形成的可能性。

2 精子DNA碎片檢測方法

雖然精子DNA完整性的檢查目前尚未納入不孕癥臨床常規檢查，但其對輔助生殖治療的短期受精評估、胚胎發育、結局預測以及長期的子代健康影響都有十分重要的意義。彗星實驗(COMET assay)被認為是目前現有的DNA碎片檢測方法中最敏感的，它可以檢測包括單鏈損傷、雙鏈損傷以及堿基位點的破壞等多種精子DNA異常[6]。通過彗星實驗檢測精子DNA碎片時，需要的精子細胞數較少，這使得彗星實驗更適合對嚴重少弱精患者精子DNA完整性進行評估。研究[7]表明，相比單純的精子活力檢查，彗星實驗在ART中具有更高的診斷和預測價值。但是，要將彗星實驗應用到常規的精子DNA實驗室檢查體系，還必須對其過程進行最優化和標準化，測定其檢測的敏感度和特異度，評估測量的重復性。

除了彗星實驗，在精子DNA碎片檢測方面應用較為廣泛的方法還有原位末端標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)、精子染色體結構試驗(sperm chromatin structure assay,SCSA)以及精子染色體擴散實驗(sperm chromatin dispersion,SCD)。其中，TUNEL實驗可以直接檢測精子DNA單鏈和雙鏈的損傷，且在檢測之前不需進行精子DNA變性，操作簡單，是目前精子DNA碎片檢查的重要方法之一。SCSA法是通過流式細胞儀分析吖啶橙與單鏈或雙鏈DNA結合后產生的不同熒光而對精子DNA完整性進行評估的一種方法，此法為定量檢測，敏感性高，操作方便，檢測時間短，能在幾秒鐘內快速檢測5 000個精子細胞，且目前已有標準化的DNA斷裂程度衡量標準，在世界范圍內得到普遍認可，甚至被稱為精子DNA碎片檢測的“金標準”。SCD法檢測精子DNA碎片時，對精子進行特定處理后可直接在光學顯微鏡進行觀察，且整個過程能夠保持精子尾部的完整。該法操作簡單，費用低廉，組間和組內變異較小，已被越來越多的機構認可。然而，任何一種檢測方法都有其本身的優缺點，要想將其應用到臨床進行精子DNA完整性的常規檢查并對ART治療結局作出相對準確的診斷和預測，尚需得到進一步研究證實。

3 精子DNA碎片與ART結局的關系

研究[8]表明，不同程度少弱精和畸形精子癥患者精子DNA碎片明顯升高。通過TUNEL實驗和彗星實驗評估DNA碎片指數(DNA fragment index,DFI)，發現DNA碎片能夠明顯影響體外受精(in vitro fertilization,IVF)和卵胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的助孕結局[9]，從精液常規分析和精子DNA碎片之間的關系發現，精液常規分析顯示精液參數異常以及由遺傳或非遺傳因素所致的非梗阻性無精癥患者精子DFI顯著增高[10]。但是，精子DNA碎片是否能夠為ART臨床提供更準確的預測信息，尚未得到一致的認可。通過研究嚙齒類動物，發現含有DNA碎片的精子雖然能夠使卵母細胞受精并形成高質量的胚胎，但與其后續的胚胎著床、胚胎發育、表觀遺傳改變、臟器肥大、神經發育和行為異常以及肺和皮膚實體腫瘤的發生都有明顯的相關性[11]。有報道稱，精子DNA碎片對IVF受精率、卵裂率、種植率和妊娠率均沒有影響[12]，而在ICSI周期中，精子DFI可對種植率和妊娠率產生明顯的負面影響[13]。許多ICSI出生的嬰兒發生生殖泌尿系統畸形被認為可能與精子挑選失敗有關。盡管如此，由于缺乏更好的治療手段和儀器設備，在嚴重少弱精和畸形精子癥等被認為含有較多精子DNA碎片的患者中，目前仍首選ICSI進行授精。精子DNA碎片與ART受精率之間的關系也一直存在爭論。有研究[14]認為，精子DNA碎片可對輔助生殖IVF和ICSI受精率產生明顯影響，導致男性生育能力低下甚至不育。而Benchaib 等[15]研究顯示，當精子DNA碎片<10%時，無論采取IVF還是ICSI授精，都不會對受精率產生影響。有研究[16]認為，精子DNA碎片對預測流產有一定的價值。但Brahem 等[17]的報道卻恰恰相反，他們認為精子DNA碎片與流產之間沒有任何關系。在最近一項有關精子DNA碎片和復發性流產的前瞻性隊列研究中也沒有發現精子DNA碎片對復發性流產有任何預測價值，在復發性流產患者夫婦中，男性精子DNA碎片指數與正常對照組之間沒有差異[18]。同樣，精子DNA碎片與卵裂期胚胎和囊胚發育之間的關系，目前仍沒有一致的結果[15,19]。

總之，精子DNA碎片對生殖過程的影響尚不能通過現有研究得出結論，但是精子DNA的完整性可能與整個生殖過程之間存在密切的關系，是生殖醫學和男科學發展中的重要課題。

4 降低精子DNA碎片的方法及對生育的影響

研究[20]認為補充抗氧化維生素及其他抗氧化劑可以有效減少精子DNA碎片，采用維生素E和維生素C進行抗氧化治療雖然能夠降低精子DNA碎片，但維生素C在發揮其抗氧化活性的同時，能夠通過打開蛋白質二硫鍵干擾父方基因活性而使精子DNA發生去濃縮，影響精子功能。高達40%的不孕男性精子ROS維持在較高水平，但由于引起精子DNA產生損傷而形成DNA碎片的ROS閾濃度并不確定，這使得抗氧化劑的使用和患者的選擇尚未得出統一的標準。有文獻[21]報道，對先天性少弱精患者經過90d的重組卵泡刺激素(recombinant follicle stimulating hormone，rFSH)的治療后，其精子DNA碎片得到了明顯的改善，但接受維生素抗氧化治療組治療前后差異并無統計學意義。而經過rFSH治療好轉后是否能夠提高ART治療的臨床妊娠率目前并不清楚。吸煙被認為與精子DNA碎片和不良精液參數有關，同時，吸煙與子代腫瘤的發生也有明顯相關[22]。有研究[23]作出推斷，精子DNA碎片可能對子代腫瘤的發生存在潛在的影響。因此，育齡期夫婦應盡量戒除吸煙等不良嗜好，遠離具有潛在生殖毒性的各種毒物和藥物，建立健康良好的行為生活方式。除了對患者進行藥物干預和行為指導，在接受輔助生殖技術助孕時，精子的體外優化處理十分重要。目前，精子的體外處理方法主要為上游法和密度梯度離心法，二者都可以很大程度對精子進行優化選擇。相比上游法，經密度梯度離心法處理后的精子具有更高的DNA完整性[24]。密度梯度離心法由于長時、高速的離心以及經受梯度試劑的影響，本身可增加精子DNA碎片。但密度梯度離心法對精子的損傷與輔助生殖的關系，除了部分研究認為密度梯度離心法可能會影響后期的囊胚發育外[19]，并無證據提示其對精子的損傷可產生更多不良后果。

5 研究前景與挑戰

傳統的精液常規檢查從形態學角度出發，采用相差顯微鏡，評估精液的4種輔助參數，即精液體積、精子密度、活力以及精子形態。但是，這些形態學特征在男性生育能力和精子功能的評估方面具有很大的局限性。從以上有關最新研究推斷，精子DNA碎片檢查可能是一種具有預測價值的精子功能評估方法，精子DNA完整性也有很大潛力成為一種生物標記物用來分析IVF過程中出現的胚胎分裂異常、高流產率及復發性流產等問題。然而，由于受當前生殖醫學對精子DNA的認識和檢測方法的限制，尚沒有標準化的精子DNA碎片檢測體系和精子DFI對生育能力的預測模型。同時，精子DNA完整性對輔助生殖技術中配子的受精、發育、種植以及臨床妊娠率和流產率的影響未能在學界達成共識，暫時只能將其作為男性生育能力評估的參考方法。因此，標準化男性精子DNA實驗室檢測技術，尋找有效的精子DNA損傷臨床治療方法，開發相對準確的ICSI精子選擇手段以及高特異無侵入性的精子功能評估方法對于現代輔助生殖技術的發展具有十分重要的意義。

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(本文編輯：許卓文)

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《河北醫科大學學報》編輯部

2014-04-02；

2014-04-21

甘肅省青年科技基金計劃項目(1107RJYA062)

王志強(1986-)，男，甘肅定西人，甘肅省婦幼保健院醫師，醫學碩士，從事人類輔助生殖技術研究。

R711.6；R21.33

A

1007-3205(2014)12-1485-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.12.045

*通訊作者。E- mail:chaisanming@163.com