調節移植干細胞功能促進梗死心肌修復的策略

黃潔,盛祖龍,姚玉宇

(東南大學醫學院,江蘇 南京 210009)

近年來,心血管疾病已成為威脅人類健康的首要因素。《中國心血管病報告2012》于2013年8月9日公布,報告指出我國心血管病患者人數約為2.9億,每10 s就有1人死于心血管疾病。因心肌梗死(MI)、心功能不全導致的死亡占心血管病死亡人數的50%以上。這類疾病的共同特征是心肌供血不足、心肌細胞數量減少從而導致心功能低下。由于心肌細胞是終末細胞,壞死后無法再生,因此若病人心臟收縮功能持續降低,最終將演變為終末期心臟病。目前,國際上對終末期心臟病沒有很好的治療手段,主要原因是缺乏針對終末期心臟病病理改變的有效方法[1]。

1 MI的干細胞治療方法

梗死后的心肌因缺乏增殖分化能力,心肌細胞無法再生,只能由成纖維細胞填充,最終被瘢痕組織替代并且逐步發生心室的重構。現有的治療包括藥物治療、冠脈介入治療,這些治療雖然可以減輕患者的癥狀,但無法從根本上改變患者心肌細胞數量缺乏的問題,心臟的功能恢復也受到阻礙。近年來,動物實驗和臨床初期研究表明,通過移植干細胞可以取代受損心肌細胞,并建立新的血管通路而恢復血供,這已成為MI治療的熱點方法。

干細胞是一類具有自我復制能力和多向分化潛能的細胞,既可以產生和自己完全相同的子代干細胞,也可以在一定條件下分化成為各種其他功能的細胞。已有多種干細胞被嘗試用于心肌細胞的再生,涉及的干細胞可分兩大類,胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞雖可以分化成為心肌細胞參與對心肌的修復，但是存在不易獲取以及倫理學方面的相關問題,此外它們在臨床上使用的安全性還有待檢驗。成體干細胞作為自體細胞,雖然在分化潛能上不如胚胎干細胞,但是卻是一種非常適合移植的細胞。現已被證明能夠誘導心肌修復的成體干細胞有骨髓干細胞[2]、骨骼肌成肌細胞、心肌干細胞和心臟祖細胞。

2 干細胞療法面臨的問題

盡管已經有了這些適合的移植細胞以供選擇,干細胞移植在治療MI方面也顯示了傳統療法不可以比擬的優越性,但在干細胞治療MI的進程中還存在諸多需要解決的問題。比如：心臟組織特異性干細胞的尋找以及分離培養的技術問題;經過體外分離培養的干細胞是一類具有多向分化能力的細胞,它們是否存在基因突變,植入機體后是否有發生癌變的可能性等。

此外將干細胞移植入梗死心肌,還面臨著移植細胞大量死亡的問題。研究顯示,移植1周后的細胞存活率低于10%,這大大降低了細胞治療的預期效果。造成移植后細胞死亡的原因是多方面的,如宿主炎癥反應、機械損傷、適應不良、缺血或缺血再灌注損傷、細胞凋亡以及干細胞來源和質量等[3]。因此,針對這一難題,我們對提高干細胞在移植后的缺血環境中生存的方法進行了深入的探討。

3 促移植干細胞存活的策略

3.1 缺血預適應(IPC)

研究發現對心臟進行短暫缺血再灌注能夠減輕心肌細胞損傷,提高心肌細胞對長時間缺血損傷的抵御能力,具有細胞保護效果。對心肌重復進行每5 min1個周期的間歇性缺血再灌注能夠顯著縮減心肌梗死面積,并且能夠激活細胞內的生存信號,此方法被稱為IPC。通過對細胞進行IPC而促進細胞存活已成為一種很有潛力的細胞保護策略[4]。

雖然IPC對心肌的保護作用已得到廣泛的認可,但是它的機制仍未被完全闡明。目前認為,此機制的信號轉導過程包括“觸發物質(內源性活性物質)- 中介物質(蛋白激酶)- 效應子(離子通道和保護蛋白)”3個環節。

首先缺血刺激可誘導機體釋放大量的內源性活性物質,如腺苷、兒茶酚胺物質、緩激肽[5]、罌粟堿以及一氧化氮(NO)。這些物質的表達水平與預適應刺激的強度以及持續時間有關,它們可以作為觸發因子引起后續一系列的反應。隨之,活性物質與受體結合后活化的蛋白激酶發揮中介效應。研究發現蛋白激酶C(PKC)[6]是一種重要的調節激酶,在IPC細胞信號轉導過程中發揮作用。另外,其它多種蛋白激酶,包括酪氨酸蛋白激酶(Src)、磷脂酰肌醇3- 激酶(PI3K)、P38 絲裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)和Janus激酶/信號轉導和轉錄激活子(JAK /STAT)通路也可作為中介物質參與到IPC過程中[7]。

最后整個信息轉導通路終止于能夠產生終末效應的離子通道。心肌纖維膜上的ATP依賴鉀離子(KATP)通道就是信號轉導途徑中終末效應物質之一,在預適應的急性時相中發揮作用[8]。近期研究也顯示,在IPC或者化學藥物誘導的預適應中,線粒體的KATP通道不僅可以作為終末效應子,還能作為中介物質發揮作用[9]。

此外,IPC的延遲保護作用與新生蛋白質的合成有關,誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)與這一保護作用關系密切。后續的研究也已表明,IPC能夠動員起內皮祖細胞表達出一系列的有潛在心肌保護作用的細胞因子,NOS就是這些細胞因子中的一員[10]。同時,IPC能夠顯著提高細胞對氧化應激的抵御能力和細胞移植的植入水平[11]。

預適應細胞提高了細胞分化潛能和旁分泌活力,多數研究認為細胞缺氧和低氧預適應能夠提高細胞的存活率,有利于MI后心臟修復,因此在移植前對干細胞進行缺血預處理是一種提高干細胞療法有效性的措施[12]。

3.2 藥物預適應

因為IPC應有一定創傷性,并存在一些潛在危險因素，導致它難以在臨床上推廣使用。但其細胞保護效應還可以通過其他一些方式來模擬,如藥物預適應。藥物預適應是指預先用具有刺激作用或輕微損傷作用的藥物處理,激發或者模擬機體中的內源性物質,如腺苷、緩激肽、前列環素(PGI2)、NO等,以調動機體對后續長期有害刺激(如缺血、缺氧等)的抵抗力。

已知通過激活線粒體通道促進細胞存活是一種內源性反應,也是自穩態調節機制的一部分[13]。這種效應可通過藥理性干預模仿完成,從而提高移植細胞的存活率。研究發現,應用KATP通道開放劑,如二氮嗪、吡那地爾,可以促進鉀離子大量涌入KATP通道,激活自穩態調節系統,保護植入的細胞[14- 16]。

基于大鼠的缺血再灌注損傷研究顯示,用KATP開放劑二氮嗪預處理心肌細胞能夠降低血清心肌酶含量、減少MI面積、維護心功能,減輕損傷。其機制可能是二氮嗪作用于KATP并開放通道,使鉀離子、水分子內流,導致線粒體基質腫脹,呼吸功能增強,防止線粒體的鈣超載[17- 18]。相反,若使用KATP通道抑制劑5- hydroxydeeanoate(5- 羥葵酸鹽)可以去除二氮嗪對心肌細胞的保護作用[19],進一步證實了二氮嗪對缺血心肌的保護作用。

近期研究中,經二氮嗪處理的間充質干細胞能通過核因子-κB活化而提高細胞生存率,同時使得PI3Κ、 蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶- 3β(GSK3β)和核轉錄因子p65(NF-κB p65)的磷酸化作用增強[20]。使用Wortmannin(渥曼青霉素,PI3K特異性抑制劑)、小分子多肽(NEMO- binding domain,NBD)、或NF-κB p50 小干擾RNA(siRNA)可以去除NF-κB p65的激活導致細胞生存下降。

除了生存信號通道的激活,藥物預處理干細胞還能引起預適應的細胞以旁分泌方式釋放生長因子和細胞因子,從而保護細胞、促進新生血管生成。此現象進一步支持了預處理誘導的信號通路中的“分泌假說”。研究發現,經過預處理的干細胞中,一些可溶性的生長因子釋放顯著增多,比如血管內皮生長因子(VEGF)、基質細胞衍生因子(SDF- 1)、干細胞生長因子(HGF)及胰島素樣生長因子I(IGF- I)。在一個實驗研究中,通過對預適應后的骨骼肌細胞進行以PCR(聚合酶鏈反應)為基礎的生長因子分析顯示,預適應能使骨骼肌細胞中的白介素11(IL- 11)以自分泌或者旁分泌形式產生,從而促進細胞生存[21]。這些實驗都清楚地表明用藥物適應細胞后不僅能激活KATP通道,而且能啟動多重分子機制,拮抗氧化應激對細胞的損傷。

藥物預處理表現出較好的可控性和重復性,并且此種處理方式相對于缺血預處理顯示了更小的毒副作用。實驗對象對這種預處理方式也表現出很好的耐受,因此藥物預適應具有良好的臨床應用前景,更易在臨床上進行推廣。

3.3 基因修飾干細胞

基因修飾是利用分子克隆技術操作目的基因,并改變生物遺傳性狀的過程。即采用類似工程技術的方法在體外進行基因重組,讓該宿主細胞具備過表達或者靜默表達某種基因的能力,從而改變宿主細胞原有的功能性狀。基因修飾主要使得干細胞過表達相關蛋白,有助于提高細胞移植效率、保護心臟功能和協助體內示蹤等。研究發現可以對細胞移植的各個階段開展基因修飾,從而解決細胞移植治療難題,促進細胞早期存活并快速有效地歸巢。

3.3.1 提高干細胞存活能力 B淋巴細胞瘤- 2(Bcl- 2)基因家族是與細胞凋亡相關的一類蛋白質,它可以抑制細胞凋亡,延長細胞生存時間。用Bcl- 2修飾過的干細胞在移植入梗死區域后存活率有顯著提高,心肌梗死面積減少,心功能明顯提高[22]。

研究顯示Akt在調節各種生長因子或者刺激其他因素誘導干細胞存活、增殖以及物質代謝等方面發揮重要作用。用Akt基因修飾間充質干細胞(MSC)后,將其注入到梗死心肌模型內,發現Akt- MSCs比未修飾過的MSCs具有更強的抗凋亡能力,移植后的凋亡率下降了80%,分化為心肌樣細胞的數目明顯增多,梗死區面積顯著減小。由此可見,Akt修飾干細胞,能有促細胞存活的功效[23]。

3.3.2 促進新血管生成,改善生存環境 因為血管發生粥樣硬化從而引起心肌細胞的壞死,最終導致缺血性心臟病的發生。如果能夠促血管生成,提高血管密度,建立側支循環,恢復血供,改善干細胞和周圍心肌細胞的微環境,便能大大減少細胞死亡,對治療MI也有極其重要的推動作用。血管生長因子可以通過刺激內皮細胞生長和遷移誘導血管生成,促進相關組織的生長和修復。VEGF是被廣泛研究的血管生長因子中的一種。外源性VEGF可促進血管生成、增加缺血區灌流、抑制內皮細胞凋亡、促進受損血管內皮愈合、抑制其下的平滑肌層病理性增厚、促進內皮依賴的血管舒張并可減少心肌缺血再灌注損傷。研究發現,如果將VEGF基因轉染干細胞可以提高干細胞治療缺血心肌的療效。過表達VEGF的單個核細胞在移植后能夠顯著增加側支血管及毛細血管的密度,并且顯著提高左心室功能[24]。目前,血管生成生長因子通過促進側支循環生長治療缺血性心臟病,為不能選擇傳統血運重建治療的患者提供幫助。

3.3.3 改善血管順應性 NO在心血管疾病治療中起重要作用。NO具有調節血壓、擴張血管、抑制血小板聚集和白細胞黏附、抑制血管平滑肌細胞增殖的作用。NO是被NOS催化而成,共有3種不同的NOS如內皮型eNOS、神經型nNOS和誘生型iNOS，其作用也各不相同。eNOS主要存在于內皮細胞中,是鈣離子和鈣調素依賴性酶,但是其活性維持非常短暫,催化的NO量也較少。所以如果能對移植細胞進行eNOS的基因修飾,成功表達eNOS重組蛋白,便可大大提高催化的NO量。

最新研究結果顯示,eNOS基因轉染MSC能安全有效地改善小型豬MI后心功能[25]。對其機制的研究認為eNOS可增強血管順應性,使得血管保持通暢[26]。同樣也發現,若將eNOS轉染到內皮祖細胞上可以起到幫助細胞遷移、促分化的作用[27]。NOS/NO系統在心血管疾病中有著重要地位,對NOS/NO的干預也成為了心血管疾病治療的新靶點。

3.3.4 增強干細胞趨化歸巢作用 許多生長因子有促細胞向心肌歸巢的能力,不同的生長因子能夠對不同類型的干細胞起動員作用。比如SDF- 1可以動員心臟干細胞、內皮祖細胞、造血干細胞以及特異性表達趨化因子受體CXCR4的間充質干細胞[28],而單核趨化因子3(MCP- 3)在MI后24 h升高達36倍,并在促進多種干細胞動員及歸巢中起重要作用[29- 30]。在急性MI發生后缺血區域生長因子富集,從而動員干細胞定位到損傷的心肌組織周圍進行修復,但是各種因子參與修復過程取決于即刻濃度、相互交錯存在的多態性及協同和拮抗作用。由于這些因子的表達時間非常有限,所以可以通過基因修飾方法對細胞進行處理,使得相應的生長因子在心肌組織內過表達并且延長其表達時間。SDF- 1α/CXCR4受體/配體系統廣泛分布于生物體內,參與細胞的生長增殖、生存和抗凋亡以及遷移、轉錄活性。研究表明,通過基因修飾延長SDF- 1在心肌組織中的表達時間,可以誘導移植細胞定位,提高血管密度,激活并動員自體心臟干細胞,改善心功能。

同時也發現如果在移植前對MSC進行處理,將細胞表面的CXCR4受體作為預適應的靶點,然后通過SDF- 1α/CXCR4受體/配體的相互作用可提高供體細胞的定位,具有改善心功能的效果[31]。因此,無論是對內源性細胞過表達細胞因子,還是對外源性植入細胞進行過表達相關細胞因子的受體,都可以起到定向動員作用,從而提高治療效率。

3.3.5 多基因修飾干細胞 隨著基因修飾干細胞的研究不斷發展,為了進一步提高干細胞的性狀,人們提出多基因修飾干細胞的設想。實際研究發現,基因修飾干細胞聯合過表達一個或多個生存信號分子可以達成這一目標。例如,血管生成素- 1(Ang- 1)是一種有效的血管發育調節基因,當它與相關受體結合后可以激活Akt生存信號通路,預處理MSC可顯著提高其抗凋亡能力,從而顯著改善心功能[32]。如果在間充質細胞上聯合過表達Ang- 1和Akt能使細胞在植入梗死大鼠心肌后更好存活,兩者的聯合效果要優于獨自單一的過表達效果[33]。此外,Akt和Ang- 1共轉染MSC,能促使大鼠MI后毛細血管和小動脈顯著增生并在3個月內顯著改善心功能[34]。

4 總 結

干細胞移植治療是目前治療心血管疾病的熱點,雖然相對于傳統方法它有著巨大優勢,但移植后的細胞大量的丟失是其面臨的最棘手的問題。移植后嚴峻的微環境使細胞難以存活,大量的細胞死亡又進一步激發免疫和炎癥反應而加劇微環境的惡化,如此反復形成惡性循環。因此,當務之急就是優化細胞移植環境,并且在移植前對細胞進行干預來承受移植后的嚴峻考驗。現階段已有許多手段可以提高干細胞治療的效果,包括IPC、藥物預適應、基因修飾干細胞。但它們各有其優缺點,所以我們需要對這些細胞保護方法進行更深入的研究并應用到臨床,從而提高干細胞治療心血管疾病的效果。

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