環境顆粒物的表觀遺傳學研究進展

付艷云，梁戈玉

(東南大學公共衛生學院，環境醫學工程教育部重點實驗室，江蘇南京 210009)

隨著工業的發展和科技的創新，越來越多的環境顆粒物進入我們的生活環境，嚴重威脅著人類健康，導致心血管疾病、呼吸系統疾病及癌癥等的發病和死亡增加。許多研究發現，環境顆粒物可誘發表觀遺傳學改變，它可以通過DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和microRNAs(miRNAs)等表觀遺傳學機制進行調控，進而引起基因表達改變，從而導致有害效應，而且這種改變往往發生在疾病產生的早期，因此環境顆粒物對人類健康長期潛在的表觀遺傳學效應受到越來越多的關注。本文主要對大氣顆粒物、富含金屬顆粒物和納米顆粒物等環境顆粒物的表觀遺傳學效應研究進展進行綜述。

1 大氣顆粒物的表觀遺傳學效應

大氣顆粒物是目前我們已知的主要環境顆粒物之一，可分為總懸浮顆粒物和可吸入性顆粒物(aerodynamic diameters＜10 μm，PM10)，由于 PM10對人類健康的危害較大，因而受到了更多的關注。PM10又可分為細顆粒物(aerodynamic diameters＜2.5μm，PM2.5)和粗顆粒物，其中 PM2.5尤為受到關注。PM2.5主要來源于石油化工燃料的燃燒、煤炭及機動車尾氣的排放，由于其體積小，比表面積大，易吸附各種有毒有機物和重金屬，因而對人類健康的危害更甚。國內外研究表明，大氣污染物，特別是PM2.5暴露與慢性炎癥性疾病，如心血管疾病、呼吸系統疾病及癌癥等的發病和死亡密切相關。2011年我國《環境空氣質量標準》已將PM2.5納入常規空氣質量評價體系。近年來，隨著表觀遺傳學研究的深入，有研究表明大氣顆粒物的有害效應與表觀基因(epigene)的表達異常有關，它可通過不同的表觀遺傳學修飾，如改變DNA甲基化和組蛋白乙酰化水平，從而影響基因的表達調控，引起相應的疾病后果。

1.1 PM10

目前，PM10與全基因組及特定基因甲基化水平改變的報道基本來自于人群研究，全基因組甲基化水平主要通過重復序列Alu和長散在核重復序列-1(long interspersed nuclear element-1，LINE-1)甲基化水平估計，但結果并不完全一致。

Tarantini等［1］以意大利一鋼鐵廠的63名健康男性工人為研究對象，應用亞硫酸氫鹽PCR-焦磷酸測序研究大氣顆粒物質對外周血全基因組甲基化和特定基因誘導型一氧化碳合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS/NOS2)基因啟動子甲基化的影響，結果顯示重復序列Alu和LINE-1甲基化水平與PM10暴露呈負相關，暴露組iNOS基因啟動子甲基化顯著降低。該小組還研究了PM10對血液炎癥基因甲基化的影響，結果發現內皮型一氧化氮合酶(nitricoxide-synthase-3，NOS3)基因甲基化與PM10暴露呈顯著負相關［2］。另一個研究小組Dioni等［3］對同樣的研究對象開展了PM10暴露對白細胞端粒酶長度(leukocyte telomere length，LTL)和端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)啟動子甲基化的影響，結果顯示，暴露人群LTL顯著性增加，但未發現這種改變與hTERT基因啟動子甲基化有關。Salam等［4］在兒童健康研究(Children's Health Study，CHS)中，對連續3學年(2004至2007年)進行呼出氣一氧化氮(exhaled nitric oxide，FeNO)測量的940名兒童的口頰細胞進行了研究，結果發現，雖然PM10暴露者具有較低的iNOS基因啟動子甲基化，但調整混雜因素后該相關性并無統計學意義。

關于PM10與組蛋白乙酰化關系的研究極少，Gilmour等［5］于2003年以肺癌細胞系A549為研究對象，對環境顆粒物是否可通過氧化應激介導組蛋白乙酰化調節白介素-8(interleukin-8，IL-8)釋放進行了探討。結果發現，PM10可通過氧化應激介導增強組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferases，HAT)活性和乙酰化組蛋白4(acetylated histone4，H4)的乙酰化作用，并因此引起IL-8釋放增加，說明組蛋白乙酰化作用引起的染色質重塑在PM10介導的肺部反應中可能發揮著重要的作用。

1.2 PM2.5

關于PM2.5表觀遺傳調控的研究，目前集中于PM2.5對全基因組及特定基因甲基化關系的影響。蘆茜［6］以 H9c2大鼠肌細胞作為研究對象，研究PM2.5對甲基化修飾狀態的影響。結果顯示，PM2.5干預心肌細胞后，β1受體基因啟動子甲基化水平明顯下降，且具有明顯劑量反應關系。在1～100μg·ml-1范圍內，隨PM2.5濃度增高，β1受體基因啟動子甲基化率逐漸減低。Soberanes等［7］以小鼠及鼠原代肺泡上皮細胞為研究對象，研究空氣污染顆粒物是否可通過線粒體ROS-JNK-DNMT1通道誘導p16基因啟動子的高甲基化，結果發現，在小鼠和肺泡上皮細胞中，PM2.5暴露增加了 ROS生成，DNA甲基轉移酶1(DNAmethyltransferase1，DNMT1)上調和p16啟動子高甲基化。因此，可以推斷PM2.5暴露的病人中，可能通過DNMT1異常上調導致主要腫瘤抑制基因的高甲基化，從而增加患肺癌的風險。

關于PM2.5與基因組甲基化關系的人群研究報道并不多，其中3個報道均來自波士頓地區標準老齡化研究(Normative Aging Study，NAS)隊列，但研究結果并不完全一致。Baccarelli等［8］以1999至2007年來自該隊列的718名老年人的1 097份血液樣本為研究對象，應用測序對重復序列Alu和LINE-1甲基化進行檢測，評估環境的顆粒污染物(PM2.5、碳黑、硫酸鹽)在不同的時間窗(4 h～7 d)對甲基化的影響。結果顯示，近期暴露于高濃度的PM2.5，可引起LINE-1甲基化下降，但未發現Alu甲基化與PM2.5暴露有關。Madrigano等［9］以同時期706名老年人的1 406個血液樣本為研究對象，采用相同的方法對重復序列Alu和LINE-1甲基化與PM2.5、碳黑和硫酸鹽的關系進行了研究，結果未發現重復序列LINE-1和Alu甲基化與PM2.5有關。Bind等［10］以2000至2009年 NAS的704名血液樣本為研究對象，研究短期和中期空氣污染對Alu和LINE-1甲基化的表觀基因(epigene)-環境交互作用的影響，結果同樣未發現重復序列Alu和LINE-1甲基化與PM2.5有關，但是研究顯示細胞間黏附分子-1(ICAM-1)及血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)與PM2.5有關。此外，Salam等［4］在CHS的研究中發現，提高PM2.5 7 d平均暴露水平與更低的iNOS基因甲基化有關，表明PM2.5暴露影響iNOS基因啟動子甲基化，但PM10暴露則未發現有同樣的效應。

1.3 其他大氣顆粒物

已有研究顯示，柴油車尾氣顆粒物(diesel exhaust particles，DEP)、碳黑顆粒物等其他大氣顆粒物也可通過DNA甲基化、miRNA調控等機制引起表觀遺傳學改變。

Liu等［11］以小鼠為研究對象，研究DEP是否可誘導體內γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)和白介素-4(IL-4)基因啟動子甲基化改變以及這種改變是否影響免疫球蛋白E(IgE)的調節，結果發現，吸入DEP和煙曲霉菌(真菌變應原)可誘導IFN-γ基因啟動子CpG-45、CpG-53、CpG-205位點低甲基化和 IL-4基因啟動子CpG-408位點高甲基化，且這兩個基因的啟動子甲基化改變與IgE水平改變有關。Jardim等［12］以人原代支氣管上皮細胞為研究對象，研究DEP暴露對miRNA表達的影響，結果發現，暴露于DEP后，人呼吸道上皮細胞中197個miRNA表達發生了明顯改變(倍數≥1.5)。對其中4個顯著性改變的miRNA(miR-513a-5p、miR-494、miR-923和miR-96)進行 qRT-PCR 驗證顯示，DEP可引起前3個miRNAs表達明顯增加以及miR-96表達明顯下降，對這4個miRNA進行靶基因預測，結果發現大部分靶基因富集在炎癥反應通道和腫瘤相關疾病中。

Baccarelli等［8］在 NAS 隊列的研究中，除 PM2.5外，同樣研究了碳黑和硫酸鹽與DNA甲基化的關系。結果顯示，近期高濃度碳黑的暴露可顯著引起LINE-1甲基化下降，但甲基化降低是否介導暴露相關的健康效應仍然需要研究，未發現Alu甲基化與碳黑暴露有明顯相關。Madrigano等［9］于同樣的隊列中研究了交通顆粒物暴露對DNA甲基化的影響，結果發現，持續45～90 d碳黑暴露增加和重復序列Alu的甲基化降低有關，在28～60 d增加碳黑暴露與LINE-1甲基化下降有關，增加硫酸鹽暴露超過90 d與重復序列LINE-1甲基化下降有關，結果充分說明持續暴露于碳黑和硫酸鹽顆粒可引起Alu和LINE-1這兩種類型重復序列甲基化的改變。

2 富含金屬顆粒物的表觀遺傳學效應

富含金屬顆粒物是指顆粒物含有致癌性和有毒的金屬，如砷和鎳等。隨著制造業的發展，人們暴露于有害金屬的機率也越來越高，且顆粒物質中的金屬成分具有不可降解性。有研究報道金屬及其化合物暴露可引起作業工人致癌，且金屬成分與顆粒物引發的有害效應有關。近年來，職業人群暴露于空氣中金屬成分引發的表觀遺傳效應引起學者的廣泛關注，研究表明，暴露于富含金屬顆粒物可引起DNA甲基化、組蛋白乙酰化及miRNA表達等表觀遺傳調控的改變。

Tarantini等［13］對暴露于富含金屬顆粒物的鋼鐵工人的研究顯示，暴露后腫瘤抑制基因APC和p16甲基化顯著性增加，Rassf1A、CDH13、TNF-α 和 IFN-γ 甲基化顯著下降，其中Rassf1A甲基化下降與鉻、鉛暴露有關，CDH13甲基化下降與鎘暴露相關，TNF-α甲基化下降與鎳和錳相關，未發現IFN-γ甲基化與任何暴露有關。該小組的研究者Hou等［14］研究了暴露于富含金屬成分顆粒物對外周血淋巴細胞(PBL)中腫瘤抑制基因(APC、p16、p53和RASSF1A)DNA甲基化的影響，結果顯示，暴露后APC、p16啟動子甲基化平均水平顯著增高，但p53、RASSF1A啟動子甲基化平均水平顯著下降。顆粒物暴露與腫瘤抑制基因DNA甲基化水平有關提示甲基化改變可能與顆粒物誘導的肺癌發生有關，與之前的研究結果一致。在此基礎上，該小組于2013年對同一樣本進一步研究了富含金屬顆粒物對炎癥基因甲基化介導的血液凝固的影響，結果發現，內源凝血酶能力(endogenous thrombin potential，ETP)增加以及內皮素-1(endothelin-1，EDN1)低甲基化和鋅暴露有關，NOS3甲基化與鋅和鐵暴露呈負相關，研究確認了EDN1和NOS3低甲基化在富含金屬顆粒物引起血液凝固中的相關機制，表明這些基因的低甲基化促進了環境誘導的高凝狀態［2］。

Cantone等［15-16］研究了富含金屬顆粒物暴露對組蛋白H3K4去甲基化和H3K9乙酰化的影響，結果發現，組蛋白3第4位賴氨酸的二甲基化(histone 3 lysine 4 dimethylation，H3K4me2)增加與空氣鉻、鉛、鐵、砷和鎳的暴露水平有關，組蛋白3第9位賴氨酸的乙酰化(histone 3 lysine 9 acetylation，H3K9ac)與空氣鎘的水平呈臨界性負相關，但這些變化與顆粒大小無關。累積暴露于鎳和砷可引起H3K4me2和H3K9ac明顯增加，且這種增加和工人工齡有關，表明長期暴露于空氣顆粒物的金屬成分可誘導組蛋白修飾，作為表觀遺傳學的新機制應受到重視。

Bollati等［17］研究了暴露于富含金屬的顆粒物后外周血白細胞中miRNAs表達的改變，結果發現，暴露于富含金屬顆粒物與氧化應激及炎癥相關的miR-222、miR-146a、miR-21的表達改變有關。暴露后miR-222和miR-21表達顯著上升，其中miR-222的表達改變與鉛暴露呈正相關，miR-146a表達在顆粒物暴露前后無顯著性差異，但與鉛和鎘的暴露呈負相關。Motta等［18］在Bollati研究的基礎上選擇暴露于最高濃度富含金屬顆粒物的10名血液樣本為研究對象，應用芯片和PCR技術分別檢測了847個人類miRNA和18個炎癥基因，結果顯示，暴露后4個miRNA呈顯著性差異表達，分別是 miR-421、miR-146a、miR-29a 和 let-7g，11個miRNA-mRNA靶向對應調控并映射多個復雜的交互作用，研究表明富含金屬顆粒暴露可能通過miRNA應答影響基因調控，直接或間接的控制炎癥基因表達，提示miRNA表達改變可能是介導機體對顆粒物及其金屬成分反應的表觀遺傳學新機制。

3 納米顆粒物的表觀遺傳學效應

納米顆粒(NPs)是指粒徑在1～100 nm的顆粒。隨著納米技術的快速發展，各種各樣的納米產品出現在我們的環境和醫學應用領域，其對健康的潛在影響及生物安全效應是目前研究的熱點之一［19］，而其是否可引起表觀遺傳修飾效應也已引起了人們的關注。近期，已有少量的研究表明NPs可引起DNA甲基化、組蛋白乙酰化、miRNA調控等表觀遺傳學效應的改變，但是總的來說，納米表觀遺傳學的研究仍屬于剛剛起步。

Gong等［20-21］以人類永生化表皮細胞HaCaT細胞為研究對象，研究了納米二氧化硅(SiO2)對基因組DNA總體甲基化水平的影響，結果顯示:在納米SiO2致HaCaT細胞損傷的過程中，DNA總體甲基化程度隨納米SiO2濃度升高而降低;同劑量納米組與溶劑對照組及微米組相比具有更低的基因組DNA甲基化水平;并且隨著納米 SiO2暴露濃度的增加，DNMT1的mRNA表達水平及甲基化相關酶代蛋白表達水平呈明顯降低趨勢。表明暴露于納米SiO2顆粒后，HaCaT細胞基因組DNA甲基化水平降低可能與DNMT1等甲基化酶有關。該小組進一步以敲除DNMT1的HaCaT細胞為研究對象，研究腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerases-1，PARP-1)啟動子甲基化是否參與調節納米SiO2誘導PARP-1 mRNA低表達，結果顯示，與對照組相比，納米SiO2處理細胞中在mRNA和蛋白水平上PARP表達顯著性下降，同時PARP-1甲基化水平明顯上升。進一步DNMT1敲除后重新激活了HaCaT細胞PARP-1的表達和啟動子甲基化，表明PARP-1啟動子低甲基化的影響至少有一部分由DNMT1介導。綜上所述，PARP-1啟動子甲基化可能參與納米SiO2誘導的PARP-1低表達的調節［22］。

Choi等［23］以人類乳腺癌細胞MCF-7和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12為研究對象，研究碲化鎘量子點(CdTe QDs)誘導的表觀遺傳和遺傳毒性的改變，結果發現，在暴露于CdTe QDs 24 h后，與對照組相比，細胞DNA結構發生顯著性改變，出現典型的核染色質凝聚、核內容物重組和線粒體嵴丟失。此外，CdTe QDs 24 h暴露還可引起組蛋白3第9位賴氨酸的去甲基化(diMeK9-H3)和5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)共區域化及H3乙酰化顯著性下降。進一步進行QDs濃度依賴性低乙酰化分析，結果顯示，低乙酰化大多發生在高濃度QDs處理組，但同時QDs極低濃度下即可發現低乙酰化，盡管在該濃度下細胞并未發生與死亡相關的形態改變，曲古菌素A(TSA)可通過HDACs改變乙酰化組蛋白的總體水平，但不能逆轉QDs引起的細胞毒性。以上結果顯示，組蛋白乙酰化的平衡對維持細胞活性至關重要，QDs處理誘導全基因組低乙酰化意味著納米材料引起的全基因表觀遺傳效應在其毒性機制研究中應受到重視。

Li等［24］以 NIH/3T3 細胞為研究對象，研究miRNAs是否參與CdTe QDs引起的細胞毒性。SOLiD測序結果顯示，CdTe QDs暴露后miRNAs表達譜受到廣泛的影響，其中 86個 miRNA表達下調，121個miRNA表達上調。進一步研究顯示，部分具有顯著性差異表達的miRNA，其表達水平呈明顯的時間-反應和劑量-反應關系，并且其趨勢和CdTe QDs引起的細胞生存抑制率一致。此外，研究還顯示，CdTe QDs處理后可通過磷酸化增加p53翻譯后修飾及其蛋白水平，并可能通過此影響初級轉錄本(pri-miRNA)轉錄及miRNA的表達。Ng等［25］以人胚肺細胞MRC5為研究對象，研究納米金誘導蛋白S基因(PROS1)的表觀遺傳調控和潛在的肺損傷，結果表明，納米金處理后人胚肺細胞中miR-155上調，并可進一步調控其靶基因PROS1基因的表達。此外，納米金還可引起細胞核染色質濃縮。

4 展 望

在環境顆粒物暴露相關效應的發生、發展中，表觀遺傳學調控作用日益凸顯。實驗室和人群的初步研究表明，表觀遺傳學修飾如DNA甲基化、組蛋白乙酰化及miRNA調控等可介導環境顆粒物污染對基因表達的影響，從而進一步解釋和闡明環境顆粒物暴露相關疾病的分子機制。由于表觀遺傳學效應發生往往在疾病產生的早期，并且具有可逆性，因此，對其進行研究還可為環境顆粒物暴露相關疾病早期診斷和預防篩選可能的標志物。但現有的報道數量較少，考察的基因角度不夠全面深入，不同的表觀遺傳學調控機制間的相互關系仍不明確，因此不能夠得到有效的結論，至于表觀遺傳生物標志的應用，則還有更長的路要走，但是隨著表觀遺傳學相關領域研究的深入，相信將來定會更完整地剖析表觀遺傳學效應在環境暴露相關疾病中的重要作用，為環境暴露相關疾病的發病機制研究提供新視野，為其早期診斷和預防提供新思路。

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