溶瘤腺病毒介導IL－24增強黑素瘤細胞MV3放療敏感性的研究

孫 超蔣 冠魏志平鄭駿年劉彥群?

溶瘤腺病毒介導IL－24增強黑素瘤細胞MV3放療敏感性的研究

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目的: 研究溶瘤腺病毒介導IL－24(ZD55－IL－24)對黑素瘤細胞MV3放療敏感性的影響。方法: 將對數生長的MV3細胞分為ZD55－IL－24聯合放療組、ZD55－IL－24組、放療組、PBS對照組。應用免疫細胞化學法檢測黑素瘤MV3細胞中Bax和Bcl－2凋亡相關蛋白的表達；應用Western blot法檢測E1A蛋白及Bax、Bcl－2、Caspase－3凋亡相關蛋白的表達。結果: 免疫細胞化學法檢測聯合治療組Bax染色強度最大，Bcl－2染色強度最小。ZD55－IL－24聯合放療作用的MV3細胞高效表達E1A，較其它組Bax的表達量增加，Bcl－2的表達量降低，Caspase－3活化更明顯。結論: ZD55－IL－24聯合放療有明顯的協同殺傷黑素瘤細胞的作用。

腺病毒科； 放療； 黑素瘤； 凋亡

惡性黑素瘤僅占皮膚癌的3%～5%，然而卻占皮膚癌死亡者的75%。1預后不良除與黑素瘤高浸潤能力直接相關外，也與其對化療、放療及免疫治療敏感性較低，易產生治療耐受有關。2溶瘤腺病毒是治療腫瘤的新技術，它具有高的感染效率，不但能直接殺傷腫瘤細胞，而且能在腫瘤細胞中高效表達治療基因。3這類病毒具備良好的腫瘤靶向性，同時克服了復制缺陷型腺病毒載體轉染效率低和治療基因表達量低的難題。4本研究采用介導IL－24基因的溶瘤腺病毒ZD55－IL－24聯合放療協同殺傷黑素瘤細胞，為進一步應用于臨床提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 介導IL－24基因的溶瘤腺病毒(ZD55－IL－24)由中國科學院上海生命科學院劉新垣院士惠贈，病毒滴度調整為3.5×1010PFU/mL，－80℃冰箱中備用。黑素瘤MV3細胞株購自南京凱基公司。兔抗人E1A一抗(美國Santa Cruz公司)。兔抗人Bax一抗、兔抗人Bcl－2一抗、兔抗人Caspase－3一抗(美國Cell Signaling公司)。

1.2 細胞培養 MV3細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液于37℃、5%CO2條件下培養。

1.3 實驗分組及治療干預 取對數生長的MV3細胞，制備單細胞懸液，計數后鋪板。培養24 h后，分為如下4組進行治療干預:ZD55－IL－24聯合放療組、ZD55－IL－24組、放療組、PBS對照組。聯合治療干預過程為:將ZD55－IL－24轉染MV3細胞，同時將處于對數生長期細胞的培養瓶倒置于治療床面，采用放療儀器美國瓦里安公司產品Varian 23EX型直線加速器進行照射。

1.4 免疫細胞化學法測定線粒體途徑凋亡蛋白表達將MV3細胞用4%的中性甲醛溶液固定30 min。PBS洗5 min×3次。滴加1%Triton100作用5 min。滴加血清進行封閉，37℃孵育15 min。吸去血清，分別滴加抗Bax和Bcl－2的第一抗體，4℃冰箱過夜。滴加生物素化的羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS緩沖液洗5 min×3次。滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min。DAB鏡下顯色，結果拍照。

1.5 Western blot檢測E1A蛋白及凋亡相關蛋白的表達 收集干預48 h后的MV3細胞，快速制備法提取總蛋白，經電泳、轉膜后雜交，一抗為兔抗人單抗，二抗為堿性磷酸酶偶聯羊抗兔多抗，以NBT/BCIP顯色，結果拍照。

1.6 統計學方法 計量資料以均數±標準差表示，采用SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差分析，假設檢驗水準為α＝0.05。

2 結果

2.1 免疫細胞化學法對線粒體途徑凋亡蛋白表達的測定 IPP圖像分析軟件計算累積吸光度(IOD)值；免疫細胞化學法觀察各組Bax蛋白、Bcl－2蛋白表達，各組Bax蛋白染色強度由小到大各組依次為:PBS對照組、放療組、ZD55－IL－24組、聯合治療組。各組Bcl－2蛋白表達染色強度由大到小各組依次為:PBS對照組、放療組、ZD55－IL－24組、聯合治療組(圖1、2)。

圖1 免疫細胞化學檢測各組Bax、Bcl－2蛋白表達(×400)

圖2 Bax和Bcl－2蛋白在不同處理組中的吸光度(IOD)比值

2.2 E1A蛋白及線粒體途徑凋亡蛋白表達的情況干預細胞48 h后，收集細胞，Western blot檢測IL－24、E1A蛋白的表達情況。灰度分析光密度比值顯示，ZD55－IL－24聯合放療、ZD55－IL－24組均可檢測到E1A蛋白的表達，兩組之間表達差異不明顯，而放療組、PBS對照組沒有表達上的變化(圖3)。灰度分析光密度比值顯示，治療組中Bax的表達顯著增加，Bcl－2的表達量有所降低，而Bcl－2在ZD55－IL－24聯合放療組作用的黑素瘤細胞中的表達降低最為明顯。實驗中還發現ZD55－IL－24聯合放療組較其它治療組能更顯著發生Caspase－3剪切，生成有活性的Caspase－3(圖3、4)。

圖3 Western blot檢測E1A、Bax、Bcl－2、Caspase－3凋亡相關蛋白的表達

圖4 線粒體途徑凋亡相關蛋白在不同處理組中的灰度分析比值

3 討論

美國腫瘤放射治療專家Weichselbaum提出將腫瘤的放射治療和基因治療兩者結合應用，即腫瘤－基因放射治療。6，7其含義是將同時具有腫瘤殺傷的基因轉入體內，在對腫瘤實施局部放療時誘導腫瘤殺傷基因表達，造成射線和基因對腫瘤的雙重殺傷作用。這樣一方面可以相對降低等效照射劑量，緩解正常組織的損傷；另一方面通過射線的局部照射來實現腫瘤殺傷基因的定位表達，為提高惡性腫瘤的治愈率及減少腫瘤復發帶來了新希望。

本實驗研究了ZD55－IL－24聯合放療模式對黑素瘤細胞的抑瘤效應及作用機制。Western blot證實ZD55－IL－24能在黑素瘤細胞內表達腺病毒復制早期蛋白E1A。誘導腫瘤細胞凋亡是抑制腫瘤生長的重要機制之一。為了闡明ZD55－IL－24聯合放療誘導黑素瘤細胞凋亡的機制，我們檢測了ZD55－IL－24單獨或聯合放療對黑素瘤細胞Bcl－2、Bax及Caspase－3蛋白的調節作用。ZD55－IL－24聯合放療作用的MV3細胞Bax的表達量增加，Bcl－2的表達量明顯降低，Caspase－3發生了明顯剪切。這些結果表明聯合治療可以通過改變促凋亡蛋白與抑制凋亡蛋白的平衡而誘導凋亡。

實驗結果表明，介導IL－24基因的溶瘤腺病毒ZD55－IL－24能明顯增強放療對黑素瘤MV3細胞的殺傷效果，放療同時不會干擾ZD55－IL－24在腫瘤細胞中的復制增殖。病毒－基因治療和放療依靠不同的機制發揮作用，對殺傷黑素瘤細胞有增強效應。

1 Viale DL，Cafferata EG，Gould D，et al.Therapeutic improvementof a stroma－targeted CRAd by incorporating motives responsive to themelanomamicroenvironment.J Invest Dermatol，2013，133(11):2576－2584.

2Ollila DW.Complete metastasectomy in patients with stage IV metastatic melanoma.Lancet Oncol，2006，7(11):919－924.

3楊春生，徐丹，蔣冠，等.Ki67啟動子調控的腫瘤增殖腺病毒對黑素瘤細胞的殺傷作用.中國麻風皮膚病雜志，2012，28 (8):535－538.

4毛立軍，鄭駿年，李望，等.攜帶白細胞介素24基因溶瘤腺病毒對膀胱癌Biu87細胞的殺傷效應.中華實驗外科雜志，2008，25(11):1479－1481.

5Seung LP，Mauceri HJ，BeckettMA，et al.Genetic radiotherapy overcomes tumor resistance to cytotoxic agents.Cancer Res，1995，55(23):5561－5565.

6Gupta VK，Park JO，Jaskowiak NT，et al.Combined gene therapy and ionizing radiation is a novel approach to treat human esophageal adenocarcinoma.Ann Surg Oncol，2002，9(5):500－504.

(收稿:2014－03－10 修回:2014－04－08)

Sensitivity to themelanoma cell line MV3 radiotherapy enhanced by oncolytic adenovirusmediated interleukin－24

SUN Chao，JIANGGuan，WEIZhi-ping，etal.DepartmentofDermatology，Affiliated Hospital ofXuzhou Medical College，Xuzhou，221002

Objective:To investigate the sensitivity to themelanoma cell line MV3 radiotherapy enhanced by oncolytic adenovirusmediated interleukin－24(ZD55－IL－24).Methods:The logarithm ic phase cells of melanoma cell line MV3 were divided into ZD55－IL－24＋radiotherapy group，ZD55－IL－24 group，radiotherapy group and PBS control group.Bax and Bcl－2 apoptosis related proteins of MV3 cells were measured by immunocytochemical staining.The expression of E1A proteins，Bax，Bcl－2 and Caspase－3 apoptosis related proteinswere detected byWestern blotting analysis.Results:The staining intensity of Bax was the strongest and the staining of Bcl－2 wasweakest in ZD55－IL－24 plus radiotherapy group，whenmeasured by immunocytochemical staining.Western blotting analysis showed that the expression of EIA was highest and the expression of Bax was also increased in ZD55－IL－24 plus radiotherapy group than other groups.The expression of Bcl－2 was decreased and the activation of Caspase－3 wasmore significant.Conclusion:ZD55－IL－24 conjugated with radiotherapy has a synergic effect in the killing ofmelanoma cells.

adenoviridae；melanoma；radiotherapy；apoptosis

國家自然科學基金資助項目(編號:81372916，81141102)

1徐州醫學院附屬醫院皮膚科，江蘇徐州，221002

2徐州醫學院腫瘤生物治療重點實驗室，江蘇徐州，221002

?通信作者