卵巢切除聯(lián)合應(yīng)用激素對綿羊股骨近端BMD及微觀結(jié)構(gòu)的影響

劉達(dá)，張譯，謝慶云，廖冬發(fā)，陳俊，鄭媛，權(quán)毅，張波

(1.成都軍區(qū)總醫(yī)院骨科，四川 成都 610083；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院附屬口腔醫(yī)院，四川 成都 610083；3.解放軍第37醫(yī)院，四川 雅安 625000)

2008年發(fā)布的《骨質(zhì)疏松癥防治中國白皮書》指出，我國50 歲以上的人群中骨質(zhì)疏松的總患病率為15.7%，而70%～80%的中老年骨折是因骨質(zhì)疏松引起的，髖部骨折是最常見的骨折部位之一，每年新發(fā)髖部骨折病例為23萬。針對骨質(zhì)疏松性髖部骨折的治療主要包括預(yù)防性藥物治療和骨折后的內(nèi)固定手術(shù)治療[1，2]。而這些治療都需要以骨質(zhì)疏松動物模型為基礎(chǔ)來進(jìn)行研究，其中包括評價(jià)藥物對髖部骨密度及力學(xué)強(qiáng)度的作用和評價(jià)內(nèi)固定植入物在局部的生物力學(xué)強(qiáng)度等相關(guān)研究。因此，采用合適的髖部骨質(zhì)疏松動物模型是進(jìn)行該領(lǐng)域研究的必要前提條件。

研究表明，綿羊髖部的解剖結(jié)構(gòu)和力學(xué)分布與人體接近，且卵巢切除術(shù)(ovariectomy，OVX)后的綿羊可模擬婦女絕經(jīng)后因雌激素水平下降而引起的骨密度(bone mineral density，BMD)及骨小梁結(jié)構(gòu)的變化[3，4]。因此，越來越多的學(xué)者選用綿羊來建立骨質(zhì)疏松大動物模型。目前的研究多集中在采用卵巢切除聯(lián)合應(yīng)用激素的方法來建立綿羊骨質(zhì)疏松模型，但大部分的研究集中在對綿羊腰椎BMD及微觀結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了評價(jià)[5-7]，缺乏對綿羊髖部、尤其是股骨近端BMD及骨組織微觀結(jié)構(gòu)的變化的相關(guān)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用去勢手術(shù)聯(lián)合應(yīng)用激素的綜合處理方法來建立髖部骨質(zhì)疏松動物模型，通過雙能X線吸收骨密度儀測量、micro-CT分析和組織學(xué)觀察評價(jià)該建模方法對綿羊股骨近端的BMD及微觀結(jié)構(gòu)的影響作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 10只健康成年雌性綿羊，年齡(4.5±0.5) 歲，體重(55.0±6.4) kg，均已過生育哺乳期，由成都軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材 手術(shù)室及術(shù)中所需器械均由成都軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。雙能X線吸收骨密度儀(Lunar Corp，Madison，WI，USA)由成都軍區(qū)總醫(yī)院門診部提供。eXplore Locus SP型Micro-CT (Healthcare，GE，USA)，輪轉(zhuǎn)式硬組織切片機(jī)(Leica-LA 2 500，Germany)，全自動顯微鏡(Leica-LA，Germany)，均由西京醫(yī)院全軍骨科研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組、BMD的測量及手術(shù) 將所有綿羊隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=5)和假手術(shù)組(n=5)。肌注速眠新Ⅱ(解放軍獸醫(yī)大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所生產(chǎn))(0.1 mL/kg)麻醉成功后，將綿羊側(cè)臥于雙能X線吸收骨密度儀的掃描臺上，采用手動分析模式測定股骨近端感興趣區(qū)域(ROI)的BMD(見圖1)，從股骨頭下、沿股骨頸方向取矩形的ROI，其寬度接近股骨頸的寬度，長度為從股骨頭下到股骨外側(cè)皮質(zhì)。測量BMD之后將綿羊仰臥于手術(shù)臺上，術(shù)區(qū)常規(guī)消毒鋪單后，切開皮膚及皮下組織，假手術(shù)組僅顯露雙側(cè)卵巢，實(shí)驗(yàn)組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。術(shù)后1月開始肌肉注射甲基強(qiáng)的松龍(0.45 mg/kg/d)，每月定期測量一次綿羊體重，根據(jù)體重調(diào)整注射劑量。連續(xù)注射10個(gè)月，最后1個(gè)月內(nèi)逐漸減量至停止。停藥后觀察1個(gè)月再次使用相同方法測量雙側(cè)股骨近端的BMD。注射激素期間，所有綿羊常規(guī)飼養(yǎng)。觀察傷口愈合情況、注射部位感染情況及注射期間和停藥后有無不良反應(yīng)。

圖1 股骨近端感興趣區(qū)域的BMD測量

1.3.2 椎體標(biāo)本的制備 去勢手術(shù)后1年，處死所有綿羊。取出雙側(cè)股骨，剔除所有的肌肉及韌帶。臺鉗夾持固定股骨，于股骨頭下垂直于股骨頸的軸向?qū)⒐晒穷^鋸斷，用內(nèi)徑為15 mm的自制環(huán)鉆于股骨頸斷面中央、順股骨頸的軸向方向鉆取標(biāo)本直至鉆透股骨近端外側(cè)皮質(zhì)，保持低速轉(zhuǎn)動并用生理鹽水保持標(biāo)本濕潤，盡可能減少因發(fā)熱而導(dǎo)致組織變性(見圖2)。將標(biāo)本制成上下面平行、高度為30 mm、直徑為15 mm的圓柱狀股骨近端松質(zhì)骨標(biāo)本。所有標(biāo)本用鹽水紗布包裹，密封于塑料袋中存儲于-20℃的條件下。實(shí)驗(yàn)前所有標(biāo)本均在室溫下自然解凍。

1.3.3 椎體標(biāo)本的micro-CT分析 在44 mm_tube_21μm_270 min_ss的條件下對標(biāo)本進(jìn)行micro-CT掃描和重建。設(shè)定重建閾值為1 000，采用Advanced Bone Analysis軟件(GE Healthcare，USA)進(jìn)行骨組織計(jì)量學(xué)分析。軟件自動生成的主要空間參數(shù)包括：a)骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction，BVF)，即骨小梁的體積除以選中區(qū)域的總體積，以%表示；b)骨表面積體積比(bone surface/bone volume，BS/BV)，即骨小梁的表面積除以骨的體積，以mm-1表示。c)骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)以μm表示；d)骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)，以mm-1表示；e)骨小梁間隙(trabecular spacing，Tb.Sp)，以μm表示。

圖2 股骨近端骨組織的鉆取

1.3.4 椎體標(biāo)本的組織學(xué)觀察 將標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定5 d，不脫鈣。依次經(jīng)70%、80%、90%、99%、100%的乙醇進(jìn)行脫水(各18 h)。然后依次浸泡塑料液，包埋后固化成塊。使用輪轉(zhuǎn)式硬組織切片機(jī)，垂直于標(biāo)本的長軸方向?qū)⒐墙M織切成厚度約30～50μm的切片。對切片進(jìn)行麗春紅三色染色，使用全自動顯微鏡觀察標(biāo)本的骨質(zhì)情況。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 術(shù)后所有綿羊活動和進(jìn)食情況正常，未發(fā)生手術(shù)并發(fā)癥。術(shù)后所有切口均無紅腫滲出，10 d后均甲級愈合。注射部位的皮膚均無感染跡象，注射期間和停藥后所有綿羊均未見異常反應(yīng)。

表1 兩組綿羊股骨近端BMD測量結(jié)果

2.2 綿羊股骨近端BMD 如表1所示，手術(shù)前兩組股骨近端平均BMD之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.883)。假手術(shù)組手術(shù)前后的平均BMD無顯著變化(P=0.103)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后的平均BMD較術(shù)前顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，下降平均為31.7%。且術(shù)后實(shí)驗(yàn)組的平均BMD顯著低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)。

2.3 micro-CT分析 通過micro-CT三維重建發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組中骨小梁數(shù)量較多，骨小梁之間連接較密集，具有較好的空間結(jié)構(gòu)；而實(shí)驗(yàn)組中的骨小梁數(shù)量明顯少于假手術(shù)組，骨小梁之間排列稀疏，局部多見骨小梁連接中斷，空間結(jié)構(gòu)明顯差于假手術(shù)組(見圖3)。對骨組織進(jìn)行骨計(jì)量學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組的BVF、Tb.Th和Tb.N顯著低于假手術(shù)組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BS/BV和Tb.Sp顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

圖3 兩組綿羊股骨近端標(biāo)本micro-CT三維重建

2.4 椎體的組織學(xué)觀察 對骨組織切片進(jìn)行麗春紅三色染色后發(fā)現(xiàn)(見圖4)，假手術(shù)組中骨小梁數(shù)量多，排列密集，連續(xù)性好，骨小梁相互之間連接形成典型的髓腔結(jié)構(gòu)。與假手術(shù)組相比，實(shí)驗(yàn)組中骨小梁的數(shù)量明顯減少，排列更為稀疏，可見多處的骨小梁斷裂，小梁之間的連續(xù)性差，典型的髓腔結(jié)構(gòu)較少見。

表2 兩組綿羊股骨近端標(biāo)本空間參數(shù)的比較

a 假手術(shù)組16倍鏡下組織學(xué)觀察 b 實(shí)驗(yàn)組16倍鏡下組織學(xué)觀察 c 假手術(shù)組50倍鏡下組織學(xué)觀察 d 實(shí)驗(yàn)組50倍鏡下組織學(xué)觀察

3 討 論

我國是一個(gè)人口老齡大國，骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率日益增加。屈波等[8]對成都地區(qū)2 457 例老年人骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病特點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)髖部骨折所占比例最高為37%。郝永強(qiáng)等[9]對上海地區(qū)5 923 例骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病特點(diǎn)研究分析顯示：髖部骨折占22%，脊柱骨折占8%。而髖部骨折骨壞死率及不愈合率高，約20%～40%可造成股骨頭缺血性壞死，50%患者可導(dǎo)致畸形，從而影響下肢功能，甚至因?yàn)榕P床容易發(fā)生墜積性肺炎、泌尿系感染、褥瘡、下肢靜脈血栓形成等并發(fā)癥，病死率高，社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重。因此如何積極、有效的預(yù)防和治療髖部骨折已經(jīng)成為臨床醫(yī)生面臨的一個(gè)難題。而相關(guān)的藥物治療及股骨近端骨折內(nèi)固定的研究必須以骨質(zhì)疏松動物模型為基礎(chǔ)來進(jìn)行，因此良好的髖部骨質(zhì)疏松動物模型是上述研究的前提條件。

目前，學(xué)者們進(jìn)行了多種骨質(zhì)疏松動物模型的研究。小鼠和大鼠等嚙齒類動物缺乏Haversian系統(tǒng)，且體積過小，不適合進(jìn)行骨組織結(jié)構(gòu)及力學(xué)特性的研究。犬類動物與人類的生理周期差別較大，且月經(jīng)期沒有性激素的波動，卵巢及子宮切除后并不能誘導(dǎo)明顯的骨量丟失[10]。靈長類動物在生理周期和骨骼結(jié)構(gòu)上與人類接近，很適合作為骨質(zhì)疏松的動物模型。然而，它們飼養(yǎng)管理要求高，實(shí)驗(yàn)操作危險(xiǎn)大，費(fèi)用昂貴；再加上醫(yī)學(xué)倫理道德的原因，該模型的獲取和使用均受到很大的限制，因此也不適合建立骨質(zhì)疏松動物模型。近年來，使用綿羊建立骨質(zhì)疏松動物模型得到了很多學(xué)者的青睞。研究表明：綿羊性情溫順，易于管理和飼養(yǎng)；價(jià)格較便宜，可大量購買；自發(fā)性排卵，激素分泌與女性類似；年老的綿羊(7～9 歲)可見哈佛系統(tǒng)的重建；且成年綿羊髖部解剖結(jié)構(gòu)及力學(xué)分布與人體接近[3，4]。因此，綿羊是適合進(jìn)行髖部骨質(zhì)疏松動物模型的建立及內(nèi)固定穩(wěn)定性的相關(guān)研究。

Augat等[5]發(fā)現(xiàn)，OVX聯(lián)合糖皮質(zhì)激素注射6個(gè)月后，松質(zhì)骨的BMD和骨小梁體積分別降低了27%和34%；12個(gè)月后兩者分別降低了33%和37%。而僅行OVX處理對上述指標(biāo)均無明顯降低作用。Schorlemmer等[6]對行OVX后的綿羊持續(xù)注射甲強(qiáng)龍(0.45 mg/kg·d)6個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，該方法使皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的生成顯著減少，皮質(zhì)骨的厚度顯著降低；1年后松質(zhì)骨的生成和松質(zhì)骨的BMD分別下降了38%和34%。Lill等[7]通過比較多種建模方法后發(fā)現(xiàn)：6個(gè)月后，OVX聯(lián)合甲強(qiáng)龍組中橈骨遠(yuǎn)端皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的BMD分別降低了12.9%～20.3%和29.6%～32.4%；而OVX聯(lián)合低鈣飲食組中皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的BMD僅降低了3.9%～5.5%和7.1%～7.4%。目前的研究對髖部周圍、尤其是股骨近端骨質(zhì)條件及微觀結(jié)構(gòu)的評價(jià)甚少。

因此，針對這些不足，本研究采用目前常用的卵巢切除聯(lián)合應(yīng)用激素的建模方法，在評價(jià)股骨近端BMD變化的基礎(chǔ)上，采用micro-CT技術(shù)和組織學(xué)觀察來評價(jià)該方法對綿羊股骨近端微觀結(jié)構(gòu)的影響作用，進(jìn)一步評價(jià)該方法建立髖部骨質(zhì)疏松動物模型的效果。借鑒WHO關(guān)于人骨質(zhì)疏松的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，以BMD下降25%作為評價(jià)模型是否成功建立的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)中，通過去勢手術(shù)聯(lián)合激素注射綜合處理12月后，綿羊股骨近端的BMD較前有顯著的下降(P<0.05)，且平均下降大于25%(31.7%)。通過micro-CT分析和組織學(xué)觀察，卵巢切除聯(lián)合應(yīng)用激素后綿羊股骨近端的骨小梁數(shù)量顯著減少，骨小梁斷裂增多，骨小梁間隙增大，失去典型的髓腔結(jié)構(gòu)，骨組織空間結(jié)構(gòu)變差，局部骨質(zhì)條件顯著下降。

通過研究我們認(rèn)為，卵巢切除聯(lián)合應(yīng)用激素的方法可以顯著降低綿羊股骨近端的BMD，顯著破壞綿羊股骨近端的微觀結(jié)構(gòu)，顯著降低局部的骨質(zhì)條件。卵巢切除聯(lián)合應(yīng)用激素的方法可用于建立髖部骨質(zhì)疏松動物模型。

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