大鼠胰島周細胞的分離培養與鑒定

劉明明，李炳蔚，王 冰，孟凡星，趙永剛，盛有明，李宏偉，修瑞娟

(中國醫學科學院北京協和醫學院微循環研究所衛生部微循環重點實驗室，北京100005)

胰島周細胞分布于胰島毛細血管和微血管管壁，是胰島微循環的重要組成細胞之一，具有維持胰島β 細胞正常生理功能的作用。胰島周細胞數量及功能異常可能是糖尿病及其并發癥的病理生理基礎［1］。周細胞具有組織來源特異性，應用胰島周細胞研究其在糖尿病發病機制中的作用更為合理。本研究旨在建立大鼠原代胰島周細胞的分離培養及鑒定方法，為研究周細胞及胰島微循環在糖尿病發病機制中的作用提供細胞學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物:SPF 級8 周齡雄性Wistar 大鼠，質量200～250 g［北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001］。本研究經中國醫學科學院微循環研究所動物倫理委員會批準。

1.2 主要實驗試劑:膠原蛋白酶V、Histopaque-1077、雙硫腙(dithizone，DTZ)(Sigma 公司);內皮細胞生長因子(Sciencell公司);兔抗大鼠vWF 抗體(Santa Cruz 公司);兔抗大鼠α-SMA抗體、兔抗大鼠PDGFR-β(Abcam 公司)和Alexa Fluor 488 驢抗兔IgG(Life Technologies 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠胰島的分離與純化:膽總管穿刺注入1 g/L 膠原蛋白酶V 10 mL，37 ℃15 min。振蕩1 000 r/min 2 min至細沙狀，10 mL Histopaque-1077 重懸，加入10 mL 培養基，2 000 r/min 20 min，吸取中間層細胞。解剖顯微鏡下分揀胰島，DTZ 染色鑒定，5% CO2，37 ℃培養72 h。

1.3.2 大鼠胰島周細胞的培養:胰島懸浮于內皮細胞培養基，2～3 d 換液，待胰島周細胞爬出并增殖至完全匯合后，消化傳代鋪EZ Slide(Millipore 公司)，5% CO2，37 ℃培養。1.3.3 大鼠胰島周細胞的鑒定:4%多聚甲醛固定;0.3%Triton X-100 15 min;PBS 清洗，4% 牛血清白蛋白37 ℃30 min;按1∶100 分別加入抗PDGFR-β，α-SMA 或抗vWF 抗體，4 ℃過夜;PBS 清洗，按1∶1 000 加入Alexa Fluor 488 驢抗兔IgG，37 ℃避光1 h，PBS 清洗;DAPI 染核，鏡檢。……