RNA干擾特異性靶向抑制兔滑膜細胞TNF-α表達

唐 強，廖 琦，郝 亮，蔡 風，彭源祥，劉春龍

(南昌大學第二附屬醫院骨科，江西南昌330006)

創傷后關節炎是繼發于高能量關節創傷的骨性關節炎，即便目前有先進的外科干預，仍有40%經歷過嚴重關節創傷的患者最終發展為骨性關節炎，其基因治療關注度越來越高。研究認為TNF-α 是創傷后關節炎性病理進程中加重軟骨破壞和基質降解最重要的炎性細胞因子之一［1］。

RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA 誘發的基因沉默，是高效阻斷哺乳動物細胞內基因表達的最有效方法。慢病毒載體感染效率高，能在傳代細胞中穩定表達，對靜止期細胞亦有較高轉染效果。目前利用RNAi 沉默TNF-α 表達的研究報道很少，本研究采用RNAi 方法，構建針對兔TNF-α 的重組慢病毒，探討其抑制兔創傷后關節炎滑膜細胞中TNF-α 基因的表達，進而為創傷后關節炎的的基因治療開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑:GV118 慢病毒3 質粒載體系統(上海吉凱基因公司);Lipofectamine 2000 試劑和Trizol 試劑(Invitrogen公司);293T 細胞系和兔創傷后膝關節炎滑膜細胞(本實驗室原代獲取);Real-time PCR 試劑盒(Toyobo 公司，QPS201);反轉錄試劑盒(Promega 公司);PRISM? 7500 Sequence Detection System(ABI 公司);培養基(Gibco 公司):DMEM-F12和胎牛血清(Hyclone 公司):20%;青鏈霉素(碧云天公司):1%無蛋白干細胞用凍存液(賽業生物科技公司)，細胞上清液TNF-α ELISA 檢測試劑盒(BD 公司)。

1.2 方法:1)siRNA 的設計與合成siRNA 由銳博生物科技有限公司設計、合成，序列如下:TNF-α-siRNA-A 靶序列5'-GCCTTCAGAACTCCATTCTCAGA-3'，正義鏈:5'-GCCUUCAG AACUCCAUUCUCAGAdTdT-3'，反義鏈:3'-dTdTCGGAAGUC UUGAGGUAAGAGUCU-5';TNF-α-siRNA-B 靶序列5'-TGGT GATTATTGATTATTTATTA-3'，正義鏈:5'-UGGUGAUUAUUG AUUAUUUAUUAdTdT-3'，反義鏈:3'-dTdTACCACUAAUAAC UAAUAAAUAAU-5';TNF-α-siRNA-C 靶序列5'-CACGTTTTC CGTGAAAACAGAGC-3'，正義鏈:5'-CACGUUUUCCGUGAAA ACAGAGCdTdT-3'，反義鏈:3'-dTdT GUGCAAAAGGCACUUU UGUCUCG-5'。2)細胞培養原代細胞取自構建的兔創傷后膝關節骨性關節炎模型，獲取原代細胞后，使用多……