SASH1通過MAP2K2和MAP4K4與ERK信號通路交互作用

王 晶，賀 勇，張繼旺，廖 娟，曾家偉，周定安*

(重慶醫科大學附屬永川醫院1.檢驗科;2.中心實驗室，重慶402160;3.都江堰市人民醫院檢驗科，都江堰611830)

SAM and SH3 domain containing 1(SASH1)基因是一種新的候選抑癌基因，在多種組織中表達，其表達減少與腫瘤的生長、入侵、轉移和預后不良密切相關。但其在腫瘤形成、增殖和轉移中的作用機制并不清楚。

細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)信號傳導途徑是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)信號通路中最重要的途徑之一，不僅可以調節細胞生長、分裂、增殖和遷移等多種生理功能，在細胞惡性轉化等病理過程中也起重要作用［1］。MAP4K4 是MAPK 信號系統的上游激酶，在細胞系中能夠調節ERK 活性的一種絲/蘇氨酸的蛋白激酶［2］。還有研究表明，MAP4K4 可激活MEK 和MEKK［3］。因此，本研究擬探討SASH1 與ERK 信號通路的兩個關鍵分子MAP2K2(mitogen activated protein kinase kinase 2)和MAP4K4 之間是否存在相互作用關系，為深一步研究SASH1 是否通過ERK 信號通路調節腫瘤細胞的增殖、轉移和凋亡等細胞功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體:大腸桿菌E.coli Top 10(康為世紀生物有限公司)，pBABE-Flag-puro 反轉錄病毒、野生型 SASH1-Pegfp-C3 質粒、MDA-MB-231 和HEK-293T 細胞(重慶醫科大學附屬永川醫院中心實驗室保存)。

1.1.2 試劑:限制性內切酶(Hind Ⅱ、KpnⅠ、XhoⅠ和HpaⅠ)和DNA T4 連接酶(TaKaRa 公司)、哺乳動物蛋白抽提試劑LY006、SBP-beads(GE 公司)、Phusion Hot Start High Fidelity Polymerase (New England Biolabs 公司)。si-RNA 設計合成(上海吉瑪有限公司完成)，引物合成和測序(上海英駿生物公司廣州分公司完成)。

1.2 方法

1.2.1 SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重組質粒的構建:對SBP-Flag-pBABE-puro 反轉錄病毒質粒多克隆位點區進行改造，合成一對含有EcoR Ⅰ、SalⅠ、XhoⅠ和HpaⅠ酶切位點的互補引物，序列如下:5'-AATTCCCGCTCGAGCGGGTTAACATGG-3' (正 義鏈)，5'-TCGACCATGTTAACCCGCTCGAGCGGG-3'(反義鏈)。將該互補序列連接到SBP-Flag-pBABEpuro 反轉錄病毒質粒，使其含有XhoⅠ和HpaⅠ酶切位點序列。……