Let-7a靶向抑制Ewing肉瘤中CDK6的表達

瞿岱彪，邵 斌，袁志峰，王 芳，余 佳，劉會文*

(1.景德鎮市第一人民醫院骨科，江西景德鎮333000;2.中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院基礎學院醫學分子生物學國家重點實驗室，北京100005)

MicroRNA(miRNA)是新近發現的在轉錄后水平起調控作用的一類非編碼RNA 分子［1］。一般而言，miRNA 是通過調控其靶基因，并可與轉錄因子、表觀遺傳因子等共同調節各種復雜生命的活動。有研究表明:Let-7 直接調控除RAS 之外的多種細胞周期蛋白，并直接抑制肺癌細胞增殖通路［2］，而在直腸癌細胞系中過表達Let-7a 后，明顯抑制了腫瘤細胞的增殖［3］。說明Let-7 家族在腫瘤細胞惡性表型中起重要的調控作用。然而，越來越多的報道證實miRNA 在Ewing 肉瘤的發展中起重要的作用［4］。因此，探索Let-7a 在Ewing 肉瘤細胞系中的表達情況及其靶基因具有非常重要的意義，可為進一步實驗提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

寡核苷酸Let-7a 成熟體(Let-7a_mimic)及其對照(Scramble 和mimic_control)(上海吉碼公司);Triol、細胞培養基(McCoy'5A)和胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)(Invitrogen 公司);青霉素及鏈霉素、丙烯酰胺、過硫酸銨(AP)和SDS(Sigma 公司);轉染試劑DharmaFECT 1(Thermo 公司);胎牛血清(HyClone公司);單克隆抗體CDK6(EPITOMICS 公司);限制性內切酶(Spe Ⅰ、Mlu Ⅰ和Kpn Ⅰ)(NEW ENGLAND 公司);Hybond-N 尼龍膜(Amersham 公司);PCR 反應體系hs primer start(Takara 公司);SK-ES-1 細胞系(美國模式菌種收集中心)。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司);X 線片(柯達公司)。

1.2 細胞培養及分組

SK-ES-1 細胞培養條件為:37 ℃、5% CO2、飽和濕度環境下分別用含10% 胎牛血清的完全培養基McCoy'5A 培養。在轉染前1 天，以合適濃度傳代，使SK-ES-1 細胞在轉染前處于對數增殖期。轉染前1 h，用無血清無雙……