熱休克蛋白70對骨骼肌細胞系(C2C12)葡萄糖代謝的影響

王 磊，王 尊，楊偉偉

(南京中醫藥大學第二臨床醫學院康復醫學系，江蘇南京210001)

熱休克蛋白70(heat shock protein，HSP70)是最重要的應激反應蛋白，其最基本功能是感受刺激和分子伴侶功能［1］。骨骼肌細胞正常狀態下HSP70 表達水平很低，當受到各種內外環境刺激時，HSP70 的表達快速的升高，起多種保護作用維持細胞內環境的穩定。研究表明HSP70 的表達水平與骨骼肌細胞葡萄糖代謝的紊亂程度相關，包括ATP 的耗竭，儲存的糖原的下降以及乳酸的積聚等［2］，提示HSP70 對骨骼肌細胞葡萄糖代謝產生影響，但具體作用及相關機制尚不清楚。本研究通過構建高表達HSP70 的C2C12 細胞系，研究HSP70 對骨骼肌細胞葡萄糖代謝影響及相關機制，為最終闡明HSP70 在骨骼肌細胞葡萄糖代謝中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達載體pTRE2hyg(Novagen 公司);含有人HSP70cDNA(ATCC57494)的質粒pAT153(德國ULM 大學Yuefei Liu 教授惠贈);RNeasy Mini Kit及real-time PCR 試劑盒(QIAGEN 公司);HSP70 抗體和ATP biolumin-escence assay 試劑(Sigma 公司);C2C12 細胞系，DMEM 培養基，G418 和小牛血清(Gibico 公司)。葡萄糖測定試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司);3H-2 －脫氧葡萄糖(放射性比活度5.4 Bq/mmol)(中國同位素總公司);HK、PK、PFK 和LDH 的活性測定試劑盒及Glut4 抗體(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組:將C2C12 細胞分為HSP70 轉染組與正常對照組，分別培養分化后進行相關指標檢測。

1.2.2 構建重組pTRE2hyg-HSP70 質粒:1)用Hind Ⅲ限制性內切酶切開含有人HSP70 cDNA 的質粒pAT153，用NheⅠ限制內切酶切開載體pTRE2hyg，補平切出的黏性末端;2)經過電泳，純化得到HSP70 cDNA 和pTRE2hyg 分子;3)將純化的HSP70和pTRE2hyg 分子按1∶3 的比例用T4 連接酶進行連接，后轉化到DH5α 菌株中，以含氨芐青霉素篩選抗性克隆。4)將挑選出的克隆進行BamHⅠ酶切鑒定后，大量制備重組質粒pTRE2hyg-HSP70?！?br>