Ano2是鈣激活氯離子通道的分子基礎

藏雨軒，方 芳，朱杭飛，向國艷，張雲喬，李璦彤，郝 峰*

(吉林醫藥學院1.生物化學檢驗教研室;2.免疫學教研室，吉林吉林132013)

鈣激活氯離子通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)是一類在內皮細胞、平滑肌細胞和神經元等細胞廣泛表達的陰離子通道，在跨上皮液體轉運、嗅覺信號傳導和平滑肌收縮等多種生理過程中扮演重要角色［1-2］，同時CaCCs 也是治療高血壓、腹瀉和某些特定腫瘤等疾病潛在的藥物靶點［3］。跨膜蛋白16家族(transmembrane protein 16)共有10 個成員，目前已證實Ano1(anoctamin 1)是CaCCs 的分子基礎［4-5］，但對其他成員的作用還不十分清楚。本實驗探討Ano2(anoctamin 2)是否是CaCCs 的分子基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內切酶、T4 連接酶和Taq 酶(Takara 公司);引物合成和測序(上海生工公司);RT-PCR 試劑盒和Trizol(Invitrogen 公司);DNA 凝膠回收試劑盒(Qiagen 公司);FRT 細胞(大連醫科大學麻彤輝教授饋贈);兔源增強型綠色熒光蛋白(EGFP)抗體和羊抗兔二抗(中杉金橋公司);F-12 基本培養基、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、氯化銫(CsCl)、N-甲基-D 葡萄糖胺(NMDG)和尼氟滅酸(niflumic acid，NFA)(Sigma 公司);胎牛血清(四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成:NCBI 查詢小鼠Ano2 基因(NM_153589)序列，設計位于開放讀碼框架兩端的引物，去除下游引物終止密碼子后加入保護堿基和相應酶切位點EcoR Ⅰ(GAATTC)和Kpn Ⅰ(GGT ACC)。上游引物:5'-CGAATTCCGTCTGAGCCGCA TGCACTTT-3';下游引物:5'-GCGGTACCTACATTGG TGTGCTGGGACC-3'。

1.2.2 RT-PCR 擴增Ano2 基因:提取小鼠視網膜總RNA，僅轉錄為cDNA，以此為模板進行PCR 反應，94 ℃預變性5 min;94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃3.5 min，30 個循環;72 ℃，10 min，PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收陽性片段。

1.2.3 pEGFP-Ano2 的構建、轉化與鑒定:EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切Ano2 與pEGFP-N3 后，16 ℃連接過夜。將重組質粒轉化入感受態DH5α，次日挑取陽性克隆，搖菌擴增，12 h 后提取質粒，酶切正確后測序。

1.2.4 穩定表達pEGFP-Ano2 細胞系的建立:將長勢良好的FRT 細胞鋪6 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養。……