維甲酸定向誘導小鼠核移植胚胎干細胞向雄性生殖細胞分化

覃 敏，黃 林，李慕軍，莫曾南*

(廣西醫科大學第一附屬醫院1.人類精子庫;2.生殖醫學研究中心，廣西南寧530021)

男性不育癥總發病率逐年升高，其中精子形態異常引起的不育或生殖力低下的占男方因素的30%～40%［1］。目前，能有效治療男性不育癥的方法是輔助生殖技術，但對于內源性生殖細胞缺如無精子癥或精子畸形綜合征患者，ART 或藥物治療無效［2］。胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)可誘導分化為成體器官不同胚層的所有細胞，因此誘導ESCs 在體外分化為雄性生殖細胞，可以為生殖發生提供一個理想的平臺［3］。而結合胚胎干細胞技術和體細胞核移植技術，可在體外培育出與患者遺傳特征完全相同的核移植胚胎干細胞(nuclear transfer embryonic stem cells，NT-ESCs)，為男性不育提供種子細胞的新來源。

NT-ESCs 理論上可分化為各個組織，但男性生殖細胞分化的研究尚少［4-5］。本研究旨在探討雄性生殖細胞定向誘導分化條件及分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性C57BL/6 小鼠25 g，雌性BALB/c 小鼠25 g［上海斯萊克動物有限公司，許可證號:SCXK(滬)2003-000］。RA、LIF、H-DMEM、bFGF、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、絲裂霉素C 等(Sigma 公司)。cleavage medium、blastocyst medium(Sage BioPharma公司)。

1.2 NT-ESCs 的培養和鑒定

構建核移植胚胎并檢測其DNA 來源［6］。重構胚常規培養，挑取形態典型，未分化的NT-ESCs 集落傳代。經形態學、堿性磷酸酶(AKP)染色、核型分析、類胚體實驗、體內分化方法鑒定。

1.3 NT-EBs 細胞誘導分化

培養3～4 d 后的NT-EBs 接種于鋪有0.1%明膠的24 孔板。加入含2 μmol /L RA、1 000 U/mL LIF、20 ng/ mL 成纖維細胞生長因子、30 ng/mL 干細胞生長因子、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、0.1 mmol/L β 巰基乙醇，2 mmol/ L 谷氨酰胺的高糖DMEM 培養液，誘導其向雄性生殖細胞分化，觀察NT-EBs 生長和形態變化。……