氟致成骨細胞內質網應激對骨轉化基因表達的影響

張亞樓，孫小娜，李 甜，馮樹梅，廖禮彬，鄧 鋒，鐘近潔*

(1.新疆醫科大學基礎醫學院組織胚胎學教研室，新疆烏魯木齊830011;2.新疆疾病預防控制中心放射衛生科，新疆烏魯木齊830011)

攝入過量氟能夠引起成年人氟骨癥。研究發現氟可以誘導成骨細胞內質網應激，同時會對成骨細胞的骨發生作用產生影響［1］。將氟誘導的成骨細胞內質網應激與骨轉化基因進行聯合系統的研究未見報道。本研究用PCR 芯片觀察成骨細胞內質網應激情況下骨轉化相關基因的變化，為探索氟中毒機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料:NaF，分析純(上海生工公司)、RNeasy Plus Mini Kit、RT2 First Strand Kit 和RT2 SYBR Green qPCR Mastermix、PCR 芯片(未折疊蛋白反應PAHS-089ZA-2 和骨發生信號通路PAHS-026ZA-2)(Qiagen 公司)。

1.2 細胞培養:原代培養人成骨細胞(鐘近潔教授贈送)，細胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養基于37 ℃、5% CO2培養箱進行貼壁培養。

1.3 凋亡細胞的流式細胞儀檢測:將成骨細胞接種于25 cm2的培養瓶中，待細胞長至鏡下細胞匯合度為80%時，加入氟化鈉(NaF)(0 和10 mg/L)作用24 h 后，制成單細胞懸液，用AnnexinⅤ和PI 雙染色在流式細胞儀上進行早期細胞凋亡的檢測。

1.4 PCR 芯片檢測:用NaF 干預成骨細胞24 h 后，提取RNA。分光光度計測定其濃度，瓊脂糖凝膠電泳測定其RNA完整性。取400 ng RNA 反轉錄合成cDNA，加樣于PCR 芯片上，于熒光定量PCR 儀上進行實時定量PCR 反應。計算每張PCR 芯片中的每個基因的Ct 值。每種處理組重復用PCR芯片測定3 次。采用2－ΔΔCt方法比較相應基因的表達量變化。表達量差異在2 倍以上者為差異有意義基因。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測凋亡結果:當氟化鈉濃度為10 mg/L時，人成骨細胞凋亡率為14.2 %?！?br>