VEGF通過上調CCN2促HUVEC遷移和血管生成

曹玉凈，呂秋霞

(河南省中醫院1.創傷骨科;2.風濕骨病科，河南鄭州450002)

骨折修復過程與機體多種細胞因子及組織之間協同作用密切相關。血管生成與骨生成關系緊密相連，尤其在骨修復過程中尤為重要［1］。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進血管生成的直接誘導因子，可出現于骨折愈合過程，特異性作用于內皮細胞，促進其增殖和血管生成，并可增加血管通透性［2］。結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF/CCN2)屬CCN 家族，能促進內皮細胞、成纖維細胞及平滑肌細胞分裂，參與血管生成和創傷愈合等重要過程［3］，但在骨形成和骨折愈合中作用尚不清楚。本實驗探討VEGF 誘導的成骨細胞中CCN2 對人臍靜脈血管內皮細胞的影響，為骨形成和骨折愈合的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)(Promocell公司)，人成骨細胞(osteoblast)(天津衛凱生物工程有限公司)，由本實驗室保存。DMEM 培養基、胎牛血清和DMSO(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)，ELISA 試劑盒(Bio Tek 公司)，CCN2 抗體和對照抗體IgG(Santa Cruz 公司);VEGF165 (Abnova 公司)。

1.2 成骨細胞上清液的制備

成骨細胞接種至6 孔板中，PBS 洗滌1 次，換成不含血清的DMEM 培養12 h。PBS 洗滌，加入含有0.2%胎牛血清的DMEM，20 ng/mL VEGF 刺激，1 h后，更換含有0.2%胎牛血清DMEM。培養6 h 后收集細胞上層清液用于遷移實驗和血管生成實驗。同時制備未加VEGF 刺激的成骨細胞作為對照組。

1.3 CCN2 基因siRNA 序列的設計及轉染成骨細胞

siRNA 片段由上海生工合成。靶向CCN2 的siRNA 序列為5'-AATGTTCTCTTCCAGGTCAGCCCT GTCTC-3'(正義鏈)和5'-AAGCTGACCTGGAAGA GAACACCTGTCTC-3'(反義鏈)。制備終濃度為80 nmol/L的siRNA-脂質體復合物，實驗組加入CCN2-siRNA 混合物，同時設置空白對照組(control)。將人成骨細胞以2 ×105個/孔接種于6 孔板，待細胞增殖至70%～80%匯合時，更換無血清培養基，采用LipofetamineTM2000 將CCN2-siRNA 轉染成骨細胞，每組實驗重復3 次。……