HCV LNAzyme對病毒5'非編碼區基因調控的特異性抑制作用

鄧益斌，農樂根，梁祚仁，張 梁，覃羽華，何 平

(右江民族醫學院附屬醫院醫學檢驗中心，廣西百色533000)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是單股正鏈RNA 病毒，含5'非編碼區、結構區(C、E 區)、非結構區(NS 區)、和3'非編碼區，其中，5'非編碼區是丙型肝炎病毒復制所必需的元件，是HCV 十分保守的序列之一，其內源性核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)在病毒基因表達調控中發揮著重要的作用，是病毒基因組中唯一的一個翻譯起始位點。因此，推測切割破壞該位點RNA 序列可能有效阻斷病毒的基因表達。鎖核酸核酶(LNAzyme)是在脫氧核酶的2 條結合臂上引入1 個或多個鎖核酸單體構建而成的新型核酸酶，與其他核酸酶相比，具有更強的分子雜交能力、更高的酶切活性和切割效率［1-4］。因此，在前期研究基礎上［5-7］，進一步針對HCV 5'非編碼區IRES 位點的AUG 起始密碼子設計合成LNAzyme，兩側臂長約18～19 nt，環結構由GGCTAGCTACAACGA 堿基組成，以陽離子脂質體介導轉染HepG2.9706 細胞系，觀察其對病毒復制與表達的抑制作用，以期為抗HCV 治療尋找專一、高效的新型分子藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2.9706 細胞是一種轉染有丙型肝炎病毒5'-NCR/C 基因并穩定表達的HepG2 細胞，含熒光素酶基因(中國人民解放軍廣州軍區空軍醫院劉光澤博士惠贈)，本室常規培養于含G418(380 ITI1)、10%胎牛血清的DMEM 培養基中，37 ℃、5% CO2條件下5～6 d 傳代1 次;DMEM 培養基、G418 和Trizol RNA 提取試劑盒等(Gibco 公司);胎牛血清(杭州四季清公司);LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);熒光定量PCR 檢測HCV RNA 試劑盒(深圳匹基公司);化學發光試劑盒(Bright-GloTM熒光素酶分析系統)(Promega 公司)。

1.2 方法

1.2.1 核酶分子設計與合成:針對HCV 5'-NCR 區IRES 位點分別設計以下幾段序……