OCT4異構體在人胚胎干細胞和間充質干細胞中的表達

傅 歆，孫雪健，曹 蕊，董 平，楊志崗，肖 苒

(中國醫學科學院整形外科醫院研究中心，北京100144)

OCT4 是含有POU 結構域的轉錄因子，有3 個異構體:OCT4A，OCT4B 和OCT4B1［1］，在維持人胚胎干細胞(human embryonic stem cell，hESC)亞全能性和自我更新能力方面有重要作用［2－3］，mRNA 結合蛋白LIN28 和維持ESC 細胞干性的另外兩個關鍵轉錄因子NANOG 和SOX2 對OCT4 的表達有調控作用。OCT4 異構體是否參與維持人間充質干細胞(human mesenchymal stem cell，hMSC)的多能性和自我更新能力缺乏研究。本實驗比較了OCT4 異構體及其調控因子在H9 hESCs、骨髓來源的間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSC)、脂肪來源的間充質干細胞(adipose derived mesenchymal stem cell，ADSC)和皮膚成纖維細胞(skin fibroblast，FB)中的表達。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細胞

高糖DMEM、PBS 和雙抗(HyClone 公司);H9 hESC 細胞培養相關試劑(Gibco 和StemCell 公司);Matrigel(BD 公司);如無特殊說明，化學藥品(Sigma公司);引物合成(北京賽百盛公司);RT-PCR 和real-time PCR 試劑(Invitrogen 和 Roche 公司);Western blot 所需試劑(北京優博奧和Thermo Scientific 公司)。一抗 OCT4 (sc-8629)、LIN28 (sc-293120)、二抗(sc-2020 和sc-2301)(Santa Cruz 公司);一抗SOX2(ab75485)(Abcam 公司);一抗OCT4 (611020 )、SSEA-4 (560073 )、Tra-1-60(560071)、StemflowTM人MSC 分析試劑盒(BD 公司);一抗CD45、CD44、CD105、CD117、CD90、CD31、CD71 和NANOG(eBiosciences 公司);二抗(A21203和A11001)(Invitrogen 公司)。

H9 hESC(WiCell 公司)(同意書編號:11-W0039)。ADSC 來源于接受抽脂術的健康人(青年女性)脂肪組織。BMSC 來源于健康志愿者(青年男性)髂骨骨髓。FB 來源于重瞼術切下的正常人皮膚組織(均知情同意)。

1.2 H9 hESC 的培養和分化潛能檢測

H9 hESC 在小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)和Matrigel 上的培養及誘導其向成纖維細胞(H9 ebF)分化的方法見參考文獻［4］。將1 ×106～2 ×106H9 hESC 注射入聯合免疫缺失(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠后腿肌肉，6 周后取材切片做HE 染色。

1.3 H9 hESC 免疫熒光染色

H9 hESC 甲醛固定后破膜液(0.2% Tween-20/PBS)37 ℃處理15 min，一抗OCT4(611010)、SSEA-4 和Tra-1-60 4 ℃過夜，二抗室溫避光3 h，Dapi 染細胞核1 min，熒光顯微鏡采集圖像。

1.4 hMSC 的定向誘導和鑒定

hMSC 成骨和成脂誘導方案及鑒定方法見參考文獻［5］。

1.5 RT-PCR 檢測

Trizol 裂解細胞提取總RNA，取1 μg 總RNA用于RT-PCR 和real-time PCR 檢測。……