敲低Txnip抑制高糖誘導的人腎小管細胞系凋亡

韋金英，史永紅，任韞卓，侯延娟，杜春陽，張連珊，段惠軍

(河北醫科大學病理學教研室，河北石家莊050017)

研究表明，高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡是導致糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的一個主要機制。高血糖引起的活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生對DN 的發展具有至關重要的作用［1］，ROS產生的主要部位是線粒體，在糖尿病血管并發癥中發揮重要作用［2］。以往的研究顯示硫氧化蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，Txnip)參與了高糖(high glucose，HG)誘導胰島β 細胞凋亡［3］。前期實驗研究也發現敲低Txnip表達抑制高糖誘導的小鼠系膜細胞凋亡是通過線粒體途徑實現的，且與P38MAPK 信號的活化密切相關［4］。Txnip 可能在氧化應激造成腎損傷過程中發揮關鍵性調節作用，減少糖尿病腎臟Txnip 的水平可能成為治療糖尿病腎損傷的有效靶點。因此，本實驗旨在觀察Txnip 與高糖狀態下腎小管細胞凋亡的關系以及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管細胞HK-2(美國標準生物品收藏中心)。兔抗Txnip、cleaved caspase-3、P38 MAPK、P-P38 MAPK(Cell signaling 公司)。小鼠抗BAX 單克隆抗體(P-19)，兔抗BCL-2、caspase-3 和細胞色素c 多克隆抗體以及pro-light HRP 化學發光檢測試劑(Tingen biotech 公司)。TUNEL 試劑盒(Promega 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組刺激實驗:常規培養細胞，待HK-2 細胞達75% ～85%匯合后，用無血清培養基同步24 h。分成4 組:正常糖組(5.6 mmol/L 葡萄糖，NG);高糖組(30 mmol/L 葡萄糖，HG)，高糖+質粒載體對照組(control shRNA Plasmid，HG+C)，高糖+VDUP1 shRNA Plasmid 組(HG +shRNA)。于刺激48 h 后收集細胞觀察。

1.2.2 末端脫氧核苷酸轉移酶介導dUTP 缺口標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡:細胞接種于8 孔Lab-Tek? 腔室玻片上，分組刺激48 h。DeadEndTM熒光TUNEL 系統檢測細胞凋亡。熒光顯微鏡下計數每個高倍視野中陽性染色細胞數和總細胞數，計算陽性細胞百分比。……