腺苷預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后VEGF 的表達

尉 娜，王建平，申小龍，譚 軍

缺血性腦血管疾病是一類常見病、多發病，其致殘率與病死率都很高，極大地危害著人們的身體健康，而腦缺血同時也是多種腦損傷疾病共同的病理生理基礎，如何減輕腦缺血后的神經損傷、提高腦組織對缺血的耐受，一直是臨床預防和治療缺血性腦血管疾病的重點和難點。腦缺血耐受的提出為防止腦缺血再灌注損傷開拓了新的研究領域，缺血預處理對大腦的保護作用對研究內源性神經保護機制和神經保護治療方法提供了新的研究方向。然而在實際的臨床工作中在患者發生腦梗死之前對大腦進行短暫的缺血預處理是不現實的，因此臨床工作中更多應該選擇藥物進行預處理，本實驗中我們選用腺苷作為預處理的藥物。用腺苷進行預處理后制備大腦中動脈腦缺血模型，再灌注后選擇不同時間點通過HE 染色后光鏡下觀察腦缺血再灌注損傷區域腦組織的病理變化，通過TTC 染色觀察腦梗死體積，運用免疫組織化學法檢測血管內皮生長因子(VEGF)的表達，探討腺苷預處理在腦缺血再灌注損傷中可能的保護機制，為臨床應用腺苷預防和治療缺血性腦血管疾病提供理論依據，同時為減輕腦梗死損傷提供一條治療思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 健康SD 大鼠60 只(雄性，體重250～300 g)由新鄉醫學院實驗動物中心提供。隨機分為假手術組(F 組)、缺血再灌注組(IR 組)、腺苷預處理組(AP 組)共3 組，這3 組根據再灌注時間隨機分為2 h、6 h、24 h、72 h 4 個亞組，每亞組5 只。F 組和IR 組大鼠于手術前3 d 開始腹腔注射生理鹽水，每天一次，每次2 ml;AP 組大鼠于手術前3 d 開始腹腔注射腺苷注射液，劑量為1.5 mg/kg，生理鹽水稀釋到2 ml，每天一次。

1.2 主要試劑 腺苷注射液(沈陽光大制藥有限公司，批準文號為國藥準字H20030320、規格為6 mg/2 ml);VEGF 多克隆抗體、即用型SABC 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);Nikon MODEL YS100 顯微鏡(Nikon);照相顯微鏡HPIAS-2000 顯微圖像定量分析系統(鄭州太陽電子科技公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立本實驗采用尼龍線栓塞法制備大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型［1，2］，并加以改良。將SD 大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 ml/kg)麻醉成功后，在頸正中線處縱向切開皮膚，分離右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)，向近端分離出頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內動脈(internal carotid artery，ICA)。結扎并離斷ECA。ICA 分離至顱底，將其分支結扎離斷，僅保留ICA 入顱的主干通暢。用動脈夾暫時夾閉ICA 和CCA，在ECA 殘端剪一小口，插入準備好的尼龍線，到達大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)的起始部，插入使其到達大腦前動脈(anterior cerebral artery，ACA)，進入深度約18 mm，阻斷MCA 血流。在ECA殘端插線處打結固定尼龍線，打開動脈夾，將尼龍線尾端用黑色記號筆涂黑后留于皮膚外1 cm，消毒并逐層縫合。阻斷MCA 2 h 后，輕輕向外抽拉尼龍線至ECA 主干，使大腦動脈Willis 環和MCA 恢復血供，保持體溫至清醒。大鼠術后單籠飼養，自由飲水和進食，并給予抗生素及補液治療。

1.3.2 切片制備 各組大鼠按照時間點取出大腦至培養皿中，切取視交叉前后各2 mm 厚的腦組織，放入4% 多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)中固定24 h 后，脫水透明，石蠟包埋切片，用于HE 染色及VEGF 免疫組化染色。

1.3.3 TTC 染色 處死大鼠取出腦組織放入-20 ℃冰箱，待組織凍硬后進行冠狀切片(片厚2 mm)。將切片放入2%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)溶液中，37℃避光染色30 min。用4%多聚甲醛固定24 h 后拍照，正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區呈蒼白色。在腦的同一部位比較各組之間梗死體積的大小，以反映腦梗死后損傷的程度。

1.3.4 VEGF 免疫組化染色方法 按照VEGF免疫組織化學染色試劑盒說明書進行，光鏡觀察并應用HPIAS-2000 顯微圖像處理系統采集圖片，每張切片隨機取8～10 個200×視野，計數VEGF 陽性細胞數，求其平均值為該張切片VEGF 陽性細胞數。

1.4 統計學方法分析 使用SPSS13.0 統計軟件進行統計學分析，結果用均數±標準差(±s)表示，數值變量資料的分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差(LSD)t 檢驗，檢驗水平α=0.05，P＜0.05 表示有統計學差異。

2 結果

2.1 TTC 染色 TTC 是一種水溶性鹽類物質，它能與有活性的線粒體脫氫酶反應生成深紅色脂溶性物質，在死亡細胞內由于線粒體脫氫酶失活所以與TTC不反應和顯色，故正常組織被染成均勻的桔紅色，而梗死灶呈白色，二者界限清晰可見。假手術組TTC 染色呈均勻桔紅色，無缺血灶。缺血再灌注組腦組織TTC染色都出現大面積的白色區，腦梗死灶明顯。腺苷預處理組白色區域較缺血再灌注組明顯縮小(見圖1)。

2.2 VEGF 蛋白表達情況 假手術組:大鼠腦組織脈絡叢可見少量VEGF 陽性表達細胞，其余腦組織偶見VEGF 陽性表達，各亞組之間未見明顯差異(見圖2);隨著腦組織缺血時間延長，缺血再灌注組和腺苷預處理組VEGF 陽性表達呈現逐漸增高后又逐漸降低的變化，2 h 開始增高，6 h 繼續增高，24 h 達到高峰，72 h 略有下降，但處于較高水平;缺血再灌注組:在大鼠的大腦皮層、紋狀體等部位的神經元及神經膠質細胞陽性表達明顯，以缺血梗死灶周邊區表達最明顯(見圖3～圖6);腺苷預處理組:腺苷預處理各亞組較缺血再灌注各亞組陽性表達形態及部位均相似，陽性表達較缺血再灌注組增高(見圖7～圖10)。各組大鼠腦組織VEGF 陽性表達強度不同，F 組各亞組中VEGF 陽性表達無明顯差別。IR 組及AP 組VEGF 陽性表達從2 h 開始逐漸增強，到24 h 達到高峰，72 h 時均有所減弱。2 h 時IR組和AP 組積分光密度值無明顯差別(P＞0.05)。6 h、24 h 及72 h 時AP 組各亞組與IR 組各相應亞組比較明顯增高(P＜0.05)(見表1)。

表1 各組別不同時間點VEGF 表達的平均積分光密度(±s)

表1 各組別不同時間點VEGF 表達的平均積分光密度(±s)

注:與F 組比較* P＞0.05，△P ﹤0.05;與IR 組比較#P＞0.05，▽P ﹤0.05

圖1 不同組別TTC 染色結果

3 討論

腦血管病是當今社會發病率、死亡率極高的一種疾病，其發病率在我國有明顯增加的趨勢且已成為死因構成的重要原因之一。缺血性腦血管病是腦血管病中較為常見的一類，極大地危害著人們的身體健康，而腦缺血同時也是多種腦損傷疾病共同的病理生理基礎，如何減輕腦缺血后的神經損傷、提高腦組織對缺血的耐受，一直是臨床研究的重點和難點，也是臨床預防和治療缺血性腦血管疾病的發展方向。短暫性腦缺血發作，即缺血預處理(ischemia preconditioning，IPC)對腦細胞有保護作用，可以減輕缺血組織的病變程度，誘導腦缺血耐受(ischemia tolerance，IT)，可抵抗以后嚴重的腦缺血。1999 年國外對141 例有或無TIA 史的卒中患者進行回顧性病例對照研究，結論支持TIA 誘導腦缺血耐受。已有的研究結果表明，缺血耐受是迄今已知的最強的內源性保護機制，是機體抵抗缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷的一種生物現象［1］。腦缺血耐受的提出為防止腦缺血再灌注損傷開拓了新的研究領域，缺血預處理對大腦的保護作用、對研究內源性神經保護機制和神經保護治療方法提供了新的研究方向。然而在實際的臨床工作中在患者發生腦損傷之前對大腦進行短暫的缺血預處理是不現實的，因此臨床工作中預處理更多應該選擇藥物來實現。藥物預處理安全、方便、易于控制劑量，用藥物替代IPC 進行預處理以達到神經保護的目的，可能將在臨床預防和治療缺血性腦血管病、腦損傷、器官移植等方面發揮重要作用。本實驗中選擇腺苷作為治療腦缺血再灌注損傷預處理的藥物。腦缺血缺氧時引起腺苷(腺嘌呤核苷)釋放，腺苷作為一種神經遞質與G 蛋白偶聯受體(主要是受體A1)結合后，激活ATP 依賴的鉀離子通道，抑制興奮性氨基酸釋放，阻止興奮性氨基酸誘導的神經元除極效應，降低細胞膜對鈣離子的通透性，擴張血管，抑制炎性細胞黏附和浸潤，抑制血小板聚集，減輕炎性細胞、自由基導致的血管內皮損傷［2］。腺苷是一種內源性神經保護劑，其發揮神經保護作用主要是通過A1 受體阻滯Ca2+內流，抑制谷氨酸和天門冬氨酸的釋放。Heurteaux 等［3］發現應用A1 受體拮抗劑可以完全阻斷缺血預處理的保護作用。近年來國內外少有腺苷預處理對腦缺血的報道，本課題組應用腺苷預防治療腦缺血再灌注損傷亦獲得了良好的效果。

近年來，研究表明，受損的腦可出現神奇的再塑性，神經元發生的機制均與血管再通有重要的相關性，所以血管生成可以為大腦修復提供新的思路［4，5］。腦缺血再灌注損傷后，提高神經系統的血管再生可以促進損傷神經元的回訪，減輕腦缺血的后遺癥，改善腦缺血后康復的臨床效果。促進血管生成機制可能涉及多個因素，主要包括生長因子、粘附分子和神經干細胞等。許多生長因子可能參與了血管生成，最具有代表性的是血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。VEGF 是一種高度特異的血管內皮細胞有絲分裂素，具有誘導血管生成的功能，VEGF 還可間接地促進神經再生、學習、記憶并抑制細胞凋亡［6，7］。目前己經證實，缺血及移植損傷能顯著上調神經元及星狀細胞VEGF 的表達［8］，這與我們在實驗中觀察到的VEGF 表達部位是一致的。在缺血區域的神經元、膠質細胞、與中樞神經系統炎癥反應有關的細胞包括反應性星形膠質細胞、小膠質細胞VEGF 的表達均明顯增加，提示其可能參與中樞神經系統的炎癥反應。因此，對中樞及外周神經系統的創傷有可能在一定程度上觸發由VEGF 介導的細胞發育事件，通過正常的血管灌流來調節生理功能以滿足代謝要求。最近有報道在脊髓挫傷模型中單次應用一定劑量的VEGF，能明顯促進行為學功能恢復［9］，且與VEGF 受體表達增高密切相關，主要表現為組織凋亡減少、血管密度增加。這說明VEGF 既有的血管形成作用，又有潛在的神經營養作用。

本實驗用腺苷進行預處理后制備大腦中動脈腦缺血模型，再灌注后選擇不同時間點通過TTC 染色觀察腦梗死體積和運用免疫組織化學法檢測血管內皮生長因子(VEGF)的表達，探討腺苷預處理在腦缺血再灌注損傷中可能的保護機制，為臨床應用腺苷預防和治療缺血性腦血管疾病提供理論依據，同時為減輕腦梗死損傷提供一條治療思路。

圖2 F 組VEGF 的表達(×200)

圖3 IR 組2 h VEGF 的表達(×200)

圖4 IR 組6 h VEGF 的表達(×200)

圖5 IR 組24 h VEGF 的表達(×200)

圖6 IR 組72 h VEGF 的表達(×200)

圖7 AP 組2 h VEGF 的表達(×200)

圖8 AP 組6 h VEGF 的表達(×200)

圖9 AP 組24 h VEGF 的表達(×200)

圖10 AP 組72 h VEGF 的表達(×200)

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