消栓腸溶膠囊對大腦中動脈栓塞大鼠遠隔腦區星形膠質細胞活化及凋亡蛋白表達的影響

王雅麗，張寧，劉菁，吳曦，王蕾，趙暉

大腦中動脈栓塞后遠離梗死灶的相關腦區在亞急性期也會發生病理改變，目前認為反應性星形膠質細胞活化、細胞凋亡是導致遠隔部位損害的重要因素[1]。腦缺血缺氧后，神經細胞出現多種形式的氧化性脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）損傷，如不及時修復，則可啟動凋亡程序。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cystein-aspartate protease 3，caspase3）是細胞凋亡過程的執行蛋白酶，多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）為最主要的底物，Caspase-3因降解PARP，而被認為是細胞凋亡的一個早期分子標志[2]。星形膠質細胞參與細胞凋亡在內的多種形式的細胞死亡調節，在繼發性腦組織損傷中的作用受到了普遍關注[3]。膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）為星形膠質細胞的特異性標志蛋白，是其活化和增殖的標志物之一[4]。通過各種有效手段保護缺血遠隔部位，抑制星形膠質細胞異常活化，阻斷凋亡信號級聯分子的活化對卒中康復具有重要意義。

補陽還五湯是治療缺血性卒中的代表方[5]，消栓腸溶膠囊以補陽還五湯為基礎，依托現代定量生物萃取工藝制備的中成藥制劑，本實驗采用大腦中動脈栓塞模型從星形膠質細胞活化以及Caspase-3、PARP的表達變化，探討消栓腸溶膠囊保護缺血遠隔腦區的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，3月齡，體重為300～350 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。飼養在首都醫科大學實驗動物中心SPF級實驗室，動物實驗設施許可證號：SYXK（JING）2010-0020。實驗條件下自然飲食，適應環境1周后進行實驗。

1.1.2 試劑與儀器 消栓腸溶膠囊，三門峽賽諾維制藥有限公司（批號20130407）；腦心通膠囊，陜西步長制藥有限公司（批號Z20025001）；兔抗GFAP單克隆抗體，北京中杉金橋公司（13114A06）；兔抗Caspase-3單克隆抗體，abcam公司（ab4051）；兔抗PARP單克隆抗體，abcam公司（Lot#784578）；山羊抗兔IgG/DylightTM488，北京中杉金橋公司（96184）；山羊抗兔IgG/Alexa Fluor 594，北京中杉金橋公司（103320）；羊血清工作液，北京中杉金橋公司（ZLI-9021）；大小鼠抓力測試儀（YLS-13A，山東科學技術設備站）；Eclipse生物顯微鏡（Nikon，日本）；圖像采集分析系統（NIS-Elements Basic Research，日本）；Centrifuge 5810R高速冷凍離心機（Eppendorf，美國）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠中動脈栓塞模型制備 參照文獻[6]線栓法制備大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）永久性缺血模型。大鼠麻醉后，仰臥位固定，在頸總動脈分叉下方剪一切口，將栓線（直徑0.265 mm，長4 cm）置于頸內動脈18 mm，扎緊動脈殘端，縫合皮膚。假手術組大鼠麻醉后，僅暴露頸內外動脈分支，不閉塞大腦中動脈。術中、術后室溫嚴格控制在24～25℃，大鼠體溫維持在36.5～37.5℃。大鼠麻醉清醒后出現明顯左側偏癱體征（不能完全伸展左前肢、行走時向左側傾倒或轉圈者）納為實驗對象。

1.2.2 分組與給藥 根據藥理實驗動物與人體臨床等效劑量換算關系確定消栓腸溶膠囊和腦心通膠囊的給藥劑量。實驗大鼠共計90只隨機分為6組，每組15只：假手術組、模型組、消栓腸溶膠囊（420 mg/kg、140 mg/kg、47 mg/kg）3個劑量組和腦心通膠囊600 mg/kg組。造模后2 h給藥組大鼠灌胃給藥1次，造模24 h再次灌胃給藥，連續給藥15 d，每天1次。假手術組、模型組灌胃等容量生理鹽水。

1.2.3 大鼠抓握力量檢測 參照YLS-13A大小鼠抓力測定儀使用說明書進行抓握力量檢測，大鼠雙前肢抓住拉力測試儀的拉力橫桿，測試者左手先固定拉力板，右手向后拉住鼠尾，松開左手，右手向后拉拽大鼠身體，大鼠為了不從橫桿滑落會抓握橫桿不放，直至滑落，讀取使大鼠滑脫的最大拉力值，每只大鼠測2次，取平均值。

1.2.4 取材與標本處理 缺血15 d后，各組隨機取4只大鼠，麻醉后，先用300 ml生理鹽水快速左心室灌注沖洗，再進行4%多聚甲醛心內灌注固定，恒定灌注時間60 min，待固定充分后，開顱取腦，切取視交叉后4 mm組織塊，投入相同固定液于4℃固定1周后，常規石蠟包埋，切片染色。

1.2.5 免疫熒光組織化學染色 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 6.0）高熱修復抗原20 min，10%羊血清封閉1 h，一抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（抗體稀釋1∶200）、PARP（抗體稀釋1∶80）、Caspase-3（抗體稀釋1∶90），于濕盒中4℃孵育40 h。二抗山羊抗兔（抗體稀釋1∶800），室溫孵育2 h后，0.01 mol/L PBS洗滌，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)封片。

1.2.6 圖像處理 在激發/發射波長470/490 nm條件下，GFAP陽性細胞呈現綠色熒光。在激發/發射波長540/580 nm條件下，PARP和Caspase-3陽性細胞呈紅色熒光。NISElements Basic Research圖像采集分析系統采集每張切片右側（缺血側）海馬區相互不重疊的3個視野，對每個視野Caspase-3陽性表達細胞計數；對每個視野GFAP、PARP陽性表達細胞進行分析，以積分光密度（integrated optical density，IOD）反映陽性表達的免疫強度。

1.2.7 統計學處理 采用SPSS 10.0進行數據處理和統計分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，大鼠抓握力量檢測數據采用重復測量的單因素方差分析，免疫熒光染色圖像分析數據進行單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗。P＜0.05具有顯著性。

2 結果

2.1 消栓腸溶膠囊對大腦中動脈栓塞大鼠前肢抓握力量的影響 造模后3 d、7 d、12 d和15 d，各組大鼠前肢抓握力量之間差異明顯（F=6.432，P=0.000；F=3.345，P=0.011；F=2.744，P=0.029；F=3.286，P=0.012），模型組和假手術組大鼠的前肢抓握力量之間差異具有顯著性（P均＜0.01）；造模后7 d，消栓腸溶膠囊420 mg/kg組大鼠前肢抓握力量較模型組增加，差異具有顯著性（P＜0.05）；造模后12 d，消栓腸溶膠囊140 mg/kg組大鼠前肢抓握力量較模型組增加，差異具有顯著性（P＜0.05）；造模后15 d，消栓腸溶膠囊420 mg/kg、140 mg/kg、47 mg/kg組和腦心通膠囊組大鼠前肢抓握力量較模型組增加，差異具有顯著性（P＜0.05或P＜0.01）（表1）。

2.2 消栓腸溶膠囊對大腦中動脈栓塞大鼠海馬GFAP表達的影響 缺血后，星形膠質細胞骨架蛋白GFAP表達增強，胞體肥大，有多個短至中等長度的增粗突起。圖像分析結果顯示，各組大鼠的海馬GFAP表達之間差異有顯著性（F=9.744，P=0.000）（圖1）。模型大鼠海馬區GFAP陽性表達較假手術組增強（P＜0.01）。消栓腸溶膠囊420 mg/kg、140 mg/kg、47 mg/kg 3個劑量組及腦心通組大鼠海馬區GFAP陽性表達較模型組減弱（P＜0.01）（表2）。

表1 各組大鼠前肢抓握力量的比較（

表1 各組大鼠前肢抓握力量的比較（

注：與模型組比較，*：P＜0.05，**：P＜0.01

組別 N（例） 3 d 7 d 12 d 15 d假手術組 8 1448.45 116.83消栓腸溶膠囊420組 9 827.46 145.10**模型組 10 935.92 309.29** 1207.05233.17** 1173.76120.77** 1205.46 271.72 707.32146.71 700.80145.09 763.00 364.97**消栓腸溶膠囊140組 9 1037.97 388.59 1043.93276.25* 899.02405.53 1114.56 268.50*消栓腸溶膠囊47組 12 919.86 189.15 819.14289.34 972.09330.77* 1023.87 205.46*F值 6.432 3.345 2.744 3.286 P值 0.000 0.011 0.029 0.012 293.41**腦心通膠囊組 8 687.05 272.82 825.00380.42 865.64318.19 1062.18 295.18 858.15357.44 834.21233.96 1013.86

圖1 各組大鼠海馬區GFAP的表達 (免疫熒光染色，×400）

2.3 消栓腸溶膠囊對大腦中動脈栓塞大鼠海馬Caspase-3、PARP表達的影響 圖像分析結果顯示，各組大鼠的海馬Caspase-3陽性細胞數及PARP表達比較差異有顯著性（F=6.362，P=0.000；F=8.863，P=0.000）（圖2～3）。和假手術組相比，大腦中動脈栓塞模型組大鼠海馬區Caspase-3陽性細胞數增多，PARP表達增強（P＜0.01）；消栓腸溶膠囊（420 mg/kg、140 mg/kg、47 mg/kg）均可不同程度減少海馬Caspase-3陽性細胞，下調PARP表達，差異較模型組顯著（P＜0.05或P＜0.01）；腦心通膠囊組大鼠PARP陽性表達也較模型組降低（P＜0.01）（表3）。

3 討論

臨床研究和動物實驗表明，腦梗死后，遠離梗死灶的紋狀體、丘腦、黑質、海馬、腦干和脊髓均可發生繼發性損害，出現低灌注狀態，神經元數量減少、功能下降和軸突再生減弱[7-8]。氧化性DNA損傷及凋亡過程的啟動是遠隔腦區神經元損害的重要機制[9]。本研究顯示：大腦中動脈栓塞15 d后，遠離梗死灶的海馬腦區Caspase-3陽性細胞明顯增多，PARP表達增強。Caspase是一組半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，Caspase-3通過降解細胞內作用底物PARP蛋白而誘發凋亡，是啟動凋亡過程的重要“執行者”。PARP為真核細胞內具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基催化活性的蛋白酶，作為重要的DNA修復酶，PARP可識別DNA單鏈斷裂位點，當DNA少量損傷時，PARP可修復DNA單鏈及雙鏈斷裂，維持基因組的完整性。當DNA大量損傷時，PARP持續激活可耗竭細胞內NAD+和ATP，降低神經細胞抗氧化損傷能力，激活凋亡關鍵蛋白酶Caspase-3，啟動細胞凋亡程序，最終導致細胞壞死或凋亡[10-11]。因此，PARP蛋白表達水平反映了DNA單鏈損傷情況及細胞修復能力[12]。本研究結果提示大腦中動脈栓塞雖不直接影響海馬區的血液供應，但可造成海馬神經細胞DNA氧化損傷，Caspase-3/PARP凋亡信號激活。

表3 消栓腸溶膠囊對海馬Caspase-3、PARP表達的影響（

注：PARP：多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶；Caspase-3：半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶3；與模型組比較，*：P＜0.05，**：P＜0.01

組別 N（例） PARP積分光密度 Caspase-3細胞數（個）/mm2假手術組 4 4889.54 1452.38** 6.45 1.86**模型組 4 8378.45 1220.79 11.46 2.57消栓腸溶膠囊420組 4 6097.10 1887.49** 7.67 2.35**消栓腸溶膠囊140組 4 6426.01 1631.63** 8.58 1.83**消栓腸溶膠囊47組 4 5341.56 1518.64** 9.67 2.64*腦心通膠囊組 4 5600.11 1411.69** 9.67 1.94 F值 8.863 6.362 P值 0.000 0.000

圖2 各組大鼠海馬區PARP的表達（免疫熒光染色，×400）

圖3 各組大鼠海馬區Caspase-3的表達（免疫熒光染色，×400）

星形膠質細胞在維持腦缺血微環境的穩態及神經元存活等方面發揮關鍵作用。研究發現，大腦中動脈栓塞后，海馬區星形膠質細胞標志蛋白GFAP表達明顯增強。Block等[13]發現，局灶性腦缺血后，丘腦、黑質網狀部、海馬和脊髓等缺血遠隔部位出現以小膠質細胞和星形膠質細胞激活為特征的炎癥改變，與本研究結果相似。

過度活化的星形膠質細胞中還原型輔酶活性增高，產生大量NO，影響DNA修飾，可促使神經元損傷和凋亡[14]。同時，增生的膠質細胞分泌大量的細胞毒性因子，如白細胞介素1-β（interleukin，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、環氧化酶2（cyclooxygenase，COX-2）和誘導型一氧化氮合酶（iducible nitric oxide synthase，iNOS），這些細胞因子相互作用，既可通過星形膠質細胞上的相應受體刺激其分裂和增生，形成膠質瘢痕，又可參與炎癥級聯反應，最終導致神經細胞壞死、凋亡[15]。

補陽還五湯為臨床治療缺血性卒中的常用有效復方，其藥理作用主要環節包括：降低腦組織的耗氧量，提高腦組織對缺血缺氧刺激的耐受性，抗自由基損傷，抑制炎性級聯反應，降低興奮性氨基酸毒性，減輕神經細胞凋亡[16-18]。消栓腸溶膠囊以該方為基礎，通過現代工藝技術制備而成，既解決了湯劑煎煮、攜帶不便的問題，又可對其制劑質量進行有效的控制。本研究結果顯示消栓腸溶膠囊可促進腦缺血大鼠肢體功能恢復，同時可減輕大腦中動脈栓塞大鼠海馬星形膠質細胞異常活化程度，抑制Caspase-3/PARP信號分子的活化。

目前治療缺血性卒中的有效藥物治療為溶栓治療，但溶栓存在安全窗的時間限制。眾多的神經保護劑，通常在動物實驗階段有效而到臨床應用則無效[19]。神經保護劑的研究困惑引發了科研工作者對卒中治療策略的深層次思索[20]。研究發現神經元、膠質細胞形成復雜的信號網絡，任何致神經元損傷的因素均可同時損傷膠質細胞，后者的一系列病理改變會加劇神經元損傷[21]。本研究發現消栓腸溶膠囊可抑制星形膠質細胞異常活化，阻抑Caspase-3、PARP凋亡信號分子激活，保護缺血遠隔腦區，為臨床上治療卒中提供實驗依據。但本研究存在的主要不足是目前尚不清楚GFAP、Caspase-3/PARP凋亡信號在缺血遠隔部位的變化規律，因此無法判斷消栓腸溶膠囊調控GFAP、Caspase-3、PARP表達的時間窗，在后續研究中，本課題組將制作不同缺血時間點的永久性大腦中動脈栓塞大鼠模型，動態觀察GFAP、Caspase-3、PARP蛋白在缺血遠隔部位的表達，分析消栓腸溶膠囊的調控作用，明確星形膠質細胞活化與細胞凋亡信號啟動的關系，準確評價消栓腸溶膠囊的治療作用。目前認為腦血流量不足、軸突退行性改變、神經營養障礙、神經遞質代謝異常等因素均與遠隔腦區的損害關系密切[22]。此外，消栓腸溶膠囊作為中藥復方，具有多成分、多靶點的治療作用特點，本研究結果僅提示消栓腸溶膠囊可通過抑制星形膠質細胞反應性增生，Caspase3/PARP蛋白激活減輕遠隔腦區損傷。在后續研究中，本課題組將進一步從氧自由基代謝、營養因子表達、神經遞質調節以及軸突再生等多個環節探討消栓腸溶膠囊對遠隔腦區的保護作用機制。

1 Karpuk N, Burkovetskaya M, Fritz T, et al.Neuroinflammation leads to region-dependent alterations in astrocyte gap junction communication and hemichannel activity[J]. J Neurosci, 2011, 31:414-425.

2 Andrabi SA, Kim NS, Yu SW, et al. Poly (ADP-ribose)(PAR) polymer is a death signal[J]. PNAS, 2006,103:18308-18313.

3 Perea G, Araque A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses[J]. Science, 2007,317:1083-1086.

4 Lee Y, Su M, Messing A, et al. Astrocyte heterogeneity revealed by expression of a GFAP-LacZ transgene[J].Glia, 2006, 53:677-687.

5 陳佩斯, 陳衛銀. 補陽還五湯研究概況[J]. 實用中醫藥雜志, 2012, 03:228-229.

6 田金洲. 血管性癡呆[M]. 北京:人民衛生出版, 2003:598-607.

7 Zhao S, Kong W, Zhang S, et al. Pretreatment with scutellaria baicalensis stem-leaf total fl avonoid prevents cerebral ischemia-reperfusion injury[J]. Neural Regen Res, 2013, 34:3183-3192.

8 Wang SS, Wang YG, Chen HY, et al. Expression of genes encoding cytokines and corticotropin releasing factor are altered by citalopram in the hypothalamus of post-stroke depression rats[J]. Neuro Endocrinol Lett,2013, 34:773-779.

9 Dihné M, Grommes C, Lutzenburg M, et al. Different mechanisms of secondary neuronal damage in thalamic nuclei after focal cerebral ischemia in rats[J]. Stroke,2002, 33:3006-3011.

10 Sairanen T, Szepesi R, Karjalainen-Lindsberg ML, et al.Neuronal caspase-3 and PARP-1 correlate differentially with apoptosis and necrosis in ischemic human stroke[J]. Acta Neuropathol, 2009, 118:541-552.

11 Siegel C, McCullough LD. NAD+ depletion or PAR polymer formation:which plays the role of executioner in ischaemic cell death[J]. Acta Physiol, 2011, 203:225-234.

12 Sriram CS, Jangra A, Kasala ER, et al. Targeting poly(ADP-ribose) polymerase1 in neurological diseases:A promising trove for new pharmacological interventions to enter clinical translation[J]. Neurochem Int, 2014,15:70-81.

13 Block F, Dihné M, Loos M. Inf l ammation in areas of remote changes following focal brain lesion[J]. Prog Neurobiol, 2005, 75:342-365.

14 Andersson M, Blomstrand F, Hanse E. Astrocytes play a critical role in transient heterosynaptic depression in the rat hippocampal CA1 region[J]. J Physiol, 2007,10:843-852.

15 Dienel GA, Hertz L. Astrocytic contributions to bioenergetics of cerebral ischemia[J]. Glia, 2005,50:362-388.

16 Zhang H, Wang WR, Lin R. Buyang Huanwu decoction ameliorates coronary heart disease with Qi def i ciency and blood stasis syndrome by reducing CRP and CD40 in rats[J]. J Ethnopharmacol, 2010, 6:98-102.

17 Wang L, Huang Y, Wu J, et al. Effect of Buyang Huanwu decoction on amino acid content in cerebrospinal fl uid of rats during ischemic/reperfusion injury[J]. J Pharm Biomed Anal, 2013, 10:143-150.

18 Kong X, Su X, Zhu J, et al. Neuroprotective effect of buyang huanwu decoction on rat ischemic/ reperfusion brain damage by promoting migration of neural precursor cells[J]. Rejuvenation Res, 2014, 6:264-275.

19 高梅, 劉睿, 杜冠華.缺血性中風治療新策略--靶向神經血管單元[J]. 中國臨床藥理學與治療學, 2008, 13:813-821.

20 劉慶山, 方亮, 王維群. 腦梗死神經血管單元的病變機制與治療策略[J]. 國際藥學研究雜志, 2011, 38:105-108.

21 Macrez R, Ali C, Toutirais O, et al. Stroke and the immune system:from pathophysiology to new therapeutic strategies[J]. Lancet Neurol, 2011, 10:471-480.

22 杜一星. 擴散性抑制與局灶性腦缺血后遠隔腦區損傷之間關系的研究[D]. 武漢:華中科技大學, 2007.

【點睛】

本研究發現消栓腸溶膠囊可抑制星形膠質細胞異常活化及Caspase-3、PARP表達，保護缺血遠隔腦區，改善缺血動物模型的行為學功能