白花蛇舌草對人骨肉瘤MG-63細胞Bax基因表達的影響＊

黃煜朗，唐毓金，△，王俊利，謝克恭，黃 可

（1.廣西醫科大學研究生學院，南寧530021；2.右江民族醫學院附屬醫院脊柱骨病外科，廣西百色；3.右江民族醫學院附屬醫院檢驗科，廣西百色533000）

骨肉瘤是兒童與青少年常見的起源于間葉組織的惡性腫瘤。隨著化學治療、手術及骨重建等治療手段的發展，有資料研究顯示目前5年總體生存率為55%～75%［1-2］，但仍是病死率極高的惡性腫瘤。因此，研究新的抗腫瘤藥并應用于臨床是提高骨肉瘤療效的重要途徑之一。本試驗通過測定白花蛇舌草注射液對骨肉瘤MG-63 細胞Bax 基因表達的影響，為進一步開發白花蛇舌草抗骨肉瘤的藥用價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人骨肉瘤細胞株MG-63 細胞為廣西醫科大學科學實驗中心惠贈，引自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 藥物與試劑 白花蛇舌草注射液購自安徽鳳陽科苑藥業有限公司（國藥準字號Z34020595，批號120601）；MTT、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。胎牛血清、高糖DMEM培養基購自Gibico 上海立菲生物技術有限公司；PBS（1 ×）、胰蛋白酶購自北京索萊寶公司；細胞培養瓶、96 孔板、15 m L 離心管購自Corning 公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen公司；引物合成由寶生物工程（大連）有限公司完成；逆轉錄試劑盒購自TaKaRa 公司；MarkerⅠ、2 ×Taq PCR Master Mix（KT201-01）、SYBR GreenⅠ試劑盒購自TianGen 公司；8 聯管購自美國Axygen 公司。

1.1.3 儀器CO2細胞培養箱MCO-18AIC、超低溫冰箱MDF-U72V購自日本SANYO公司；生物安全柜BHC-1300ⅡA／B3 購自蘇凈集團安泰公司；電熱恒溫水槽DK-8D 型購自上海精宏實驗設備有限公司；臺式離心機購自上海安亭科學儀器廠；酶標儀（Multiskan MK3 Thermo），PCR儀（BIO-RAD），倒置顯微鏡（Leica 型號DMIL）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人骨肉瘤MG-63 細胞接種于培養瓶，加入體積分數為10%胎牛血清的DMEM培養基（以下簡稱培養基）5 m L，置于5%CO2、37 ℃細胞培養箱中常規培養，每2 d傳代1 次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制 取對數生長期的細胞用0.25%胰酶消化后加培養基5 m L吹打成混懸液，計數后調整細胞濃度，取150μL（5 ×103個）接種于96 孔板。將白花蛇舌草注射液與培養基配制成50、100、200、300、400μL／m L不同濃度含藥液，現配現用。待細胞貼壁后，棄去培養基，加入不同濃度的含藥液，并設空白對照組（只加相同量培養基），每組5個復孔。培養24 h 后，加入20μL的5 mg／mL MTT，繼續培養4 h 后棄去含藥液，加入150μL DMSO，37 ℃恒溫搖床震蕩10 min，待結晶完全溶解后，在酶標儀上492 nm波長測定吸光度（A）值，取平均值，計算細胞抑制率。計算公式：細胞增殖抑制率（RI）＝（對照組A值-藥物組A值）／對照組A值×100%。

1.2.3 Bax 基因表達

1.2.3.1 總RNA提取 取對數生長期細胞，調整為1 ×105個／mL，接種于培養瓶，待細胞貼壁后加100μL／mL含藥培養基5 m L，分別培養6、12、24、48 h，按照Trizol 提取試劑說明書進行總RNA提取。紫外分光光度計測定總RNA濃度，取A260／A280在1.80～2.20 之間用于RT-PCR。

1.2.3.2 cDNA合成 參照逆轉錄試劑盒說明SYBR Premix Ex Taq TMⅡ（RR820A），將RNA逆轉錄成cDNA。

1.2.3.3 RT-PCR檢測 參照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）（RR047A）試劑盒說明。25.0μL 反應體系包括SYBR Permix Ex TaqⅡ12.5μL，上下游目的及內參（β-actin）引物（表1）各0.5μL，cDNA 1.0 μL，dd H2O 10.5μL。將25.0μL體系設3 個復孔，加入8 聯管中，使用PCR儀進行擴增，95℃變性30s，95℃PCR反應5 s、63 ℃退火30 s，共計40 個循環的PCR反應，重復實驗3 次。反應結束后得到擴增曲線和溶解曲線，計算2-△△Ct值。

表1 RT-PCR 引物

1.3 統計學處理 使用SPSS17.0 軟件進行統計分析，計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 白花蛇舌草注射液對MG-63 細胞增殖抑制作用MTT法檢測結果示：（1）白花蛇舌草注射液對MG-63 細胞的抑制作用呈濃度依賴，當白花蛇舌草注射液濃度為200μL／m L、作用24 h 可見絕大部分細胞變圓、脫落、死亡。濃度在50μL／mL時抑制作用不明顯（P＞0.05），而濃度為100μL／m L 時有明顯的抑制作用（P＜0.05）。取濃度為100μL／m L進行下一步實驗，見表2。（2）倒置顯微鏡下觀察濃度為100μL／m L白花蛇舌草注射液對MG-63 細胞不同作用時間的細胞形態。空白對照組細胞狹長、形態多樣，較緊密地貼壁生長，加藥組（加藥6 h組、12 h 組、24h 組及48h 組）細胞隨著藥物作用時間的延長，細胞逐漸皺縮、細胞間間隔變大，增殖被抑制，見圖1。

2.2 Bax 基因的表達水平 RT-PCR 檢測結果顯示，Bax 基因溶解曲線無非特異擴增和引物二聚體，見單一峰，無雜峰，結果可信，見圖2。取100μL／m L白花蛇舌草注射液分別作用于MG-63 細胞6、12、24、48h 后，Bax 基因表達水平明顯高于空白對照組（P＜0.05），組間差別有統計學意義（P＜0.05），且呈時間依賴性，提示白花蛇舌草注射液抑制細胞增殖可能是通過上調Bax 基因表達而實現，見表3。

表2 不同濃度白花蛇舌草注射液對MG-63細胞的增殖抑制比較（±s）

表2 不同濃度白花蛇舌草注射液對MG-63細胞的增殖抑制比較（±s）

白花蛇舌草注射液濃度（μL／mL） 抑制率（%）005015．42±0．4310067．21±0．2720095．38±0．3130098．73±0．5640098．46±0．43

圖1 倒置顯微鏡觀察的結果（×200）

圖2 RT-PCR 檢測結果

表3 Bax基因的表達水平（±s）

表3 Bax基因的表達水平（±s）

組別 Bax基因空白對照組1．00±0．00加藥6 h 組 5．39 ±0．388加藥12 h 組 7．73 ±0．291加藥24 h 組 16．91 ±0．414加藥48 h 組23．42±0．335

3 討 論

細胞凋亡是在凋亡信號作用下，由基因調控細胞主動死亡的過程，其形態主要表現為細胞固縮、染色質凝聚邊集及形成凋亡小體［3］，現代研究認為腫瘤的藥物治療主要通過誘導細胞凋亡而達到治療目的［4］。Bax 基因是屬于Bcl-2 基因家族中調節細胞凋亡的促進基因，表達于多種腫瘤細胞中，其抗腫瘤的機制是通改變線粒體膜通透性，使細胞色素C及鈣離子和小分子物質進入細胞質中，激活Caspase-3，使與細胞周期及DNA修復等相關蛋白或激酶失活，導致細胞凋亡［5］。當Bax基因過度表達則形成Bax-Bax 二聚體，誘導細胞凋亡；而Bcl-2基因表達增高形成Bax-Bcl-2 二聚體時細胞凋亡被抑制，因此Bax 基因與Bcl-2 基因的比例在一定程度上決定著細胞是否凋亡［6］。中藥提取物作為抗腫瘤藥物是目前研究的熱點，Mousavi 等［7］研究發現乳腺癌細胞在濃度為200～2000μg／m L的紅花提取物中增殖受抑制，Bax 基因表達增高。Tsai 等［8］研究也表明，樟芝提取物可通過提高Bax 基因表達，降低Bc l-2 基因表達而達到誘導口腔癌細胞OCE-M1 和OC-2 凋亡。

白花蛇舌草屬于茜草科草本植物的全草，具有清熱解毒、活血散結、利水消腫的功效。近年來研究發現，白花蛇舌草的主要成分為蒽醌類、熊果酸、齊墩果酸、三萜類、多糖類、香豆素類及甾醇類等，具有抗菌、抗氧化、增強免疫功能，并通過調控Ras、C-myc、Bcl-2 等基因表達而具有不同的抗腫瘤作用［9-12］。白花蛇舌草注射液為中藥白花蛇舌草提取制成的單味藥滅菌水溶液。本實驗發現濃度為100μL／m L 的白花蛇舌草注射液作用6 h 后，倒置顯微鏡觀察可見MG-63 細胞逐漸皺縮變小、核深染，隨著時間延長，細胞變圓、懸浮死亡，與Wilde 等［13］報道一致。PCR結果顯示促凋亡的Bax 基因高表達，說明白花蛇舌草注射液對骨肉瘤MG-63 細胞具有抑制作用的機制可能是通過上調Bax 基因的表達來實現的。

綜上所述，本實驗立足于本地區豐富的中藥資源，對白花蛇舌草作用于骨肉瘤細胞的機制進行部分研究，有利于白花蛇舌草的藥用開發及研制抗骨肉瘤的新藥提供實驗依據。

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