霍奇金淋巴瘤細胞SHP1表達與CD99表達的關系＊

雷翔慧，湯 瑤，吳自勍，趙 彤△

（1.南方醫科大學基礎醫學院病理學系，廣州510515；2.南方醫科大學中西醫結合醫院病理科，廣州510515）

SH2 結構域酪氨酸磷酸化酶（SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase，SHP-l），主要表達于造血細胞的細胞質，是白血病、淋巴瘤細胞的抑癌基因，其異常表達與淋巴瘤的增殖、分化、凋亡有密切關系，表達缺失會導致淋巴瘤的發生［1-3］。霍奇金淋巴瘤（hodgkin lymphoma，HL）是淋巴造血系統的一類腫瘤，SHP1 表達在HL 情況，尚未見文獻報道，國外和本課題組之前研究發現HL的發生與CD99 蛋白表達缺失密切相關，CD99表達缺失是H L形成的一個重要分子事件［4-5］，但SHP1表達與CD99表達的關系如何，非常值得探討，為此本文在以往研究基礎上，檢測SHP1 在HL中的表達及其與CD99 的作用關系，探討SHP1 表達在HL中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與細菌B 淋巴母細胞株IM9 細胞、漿母細胞株KM3 細胞、HL 細胞株L428 細胞和L428-CD99（上調CD99 的L428 細胞）細胞，由南方醫科大學病理學系保存。采用澳洲進口胎牛血清（無需額外滅活），RPMI-1640 培基配制成含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基，37 ℃恒溫，5%CO2培養箱中孵育。

1.1.2 試劑與材料RPMI-1640 培養基、胎牛血清購自南美洲Gibeco 公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF和BCA-100 蛋白質定量測定試劑盒購自凱基公司；β-ac t in 抗體、二抗購自北京中衫金橋生物技術有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒購自碧云天公司，試劑盒組成：30% AcroBis、1 mo L Tris-Hcl（p H 8.8）、10%SDS、過硫酸銨、TEMED、1 mo L Tris-Hcl（p H 6.8）；SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液（5 ×）、蛋白預染Marker、PVDF膜、脫脂奶粉購自廣州斯佳公司；Beyo ECL Plus 發光試劑盒購自凱基公司。人SHP1抗體購于美國CST公司，CD99抗體購于Epitomic 公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR（RT-PCR）Trizol、RT-PCR提純試劑盒、逆轉錄試劑盒（日本Takara 公司），7500Software v2.0.1，引物構建于Invitrogen 公司，GAPDH上游引物：5′-ACA GTC AGC CGC ATC TTC TT-3′，下游引物：5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′；CD99上游引物：5′-GCC CAG CAA CAA GCA AAG CAC AT-3′，下游引物：5′-CCC AAC CAC CCT AGT TCC TCC G-3′92 ℃2 min 30 s、72 ℃40 s、55 ℃退32 s 40 s；SHP1上游引物：5′-ATC TGA GGC TTA GTC CCT GAG C-3′，下游引物5′-CTG AGG TCT CGG TGA AAC CAC-3′，92 ℃2 min 30 s、72 ℃40 s、55 ℃32 s 40 s。20μL體系。

1.2.2 Western blot 檢測 Western blot 培養的細胞收集各樣本蛋白（蛋白裂解液購自碧云天），SDS-PAGE電泳：配置10%濃度的分離膠，5%的積層膠；取50μg 蛋白質與5 ×SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液混合上樣量，積層膠80 V 30 min，分離膠100 V 120 min；冰浴下轉膜100 m A 120 min。5% TBST封閉1.5～2.0 h；SHP1 兔抗人單抗（1∶2000 稀釋），CD99 兔抗人單抗（1∶5000 稀釋），4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1 h，熒光成像儀內曝光。

1.2.3 熒光共聚焦實驗6 孔板培養L428 細胞48 h，再用無血清培養24 h，收取對數生長期的細胞，細胞懸液密度為1 ×106個／mL，1000 r／min，離心5 min，細胞沉淀0.01 mol／L，PBS 洗滌2～3 次；1000 r／min，離心5 min，棄去上清液；95%乙醇固定15 min，Triton X-100 破膜10 min。0.01 mol／L PBS洗滌3 次，5min，3% H2O28min，0.01mol／L PBS洗滌3 次，5 min，血清封閉5 min，甩去血清，分別用鼠抗人CD99、SHP1抗體孵育，4 ℃過 夜；0.01 mol／L PBS洗滌3次滴加相應的二抗，37 ℃避光孵育30 min；PBS 沖洗；DPAI 復染，觀察拍照。

1.2.4 Si-RNA片段瞬時干擾6 孔板細胞培養，細胞密度為1 ×106個／mL，實驗組加入10μL干擾片段＋240μL OPTIIMEN，靜置20 min，240μL OPTIIMEN＋10μL Lip2000，混合后靜置20 min，加入細胞中；對照組加入500μL 培基；37 ℃孵育，分別于48、72 h 進行細胞相關檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0 統計軟件進行分析；采用兩個獨立樣本的非參數檢驗進行組間比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 L428、IM9、KM3 淋巴瘤細胞SHP1和CD99 mRNA表達IM9中SHP1 mRNA高表達，而KM3、L428細胞中SHP1 mRNA表達較低；且與CD99 的表達趨勢相一致，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 RT-PCR 檢測IM9、KM3、L428 細胞中SHP1 和CD99 m RNA表 達

2.2 L428細 胞 和L428-CD99細 胞SHP1 mRNA表 達L428-CD99 細胞較L428細胞SHP1 mRNA表達要高，且與CD99 的表達趨勢相一致，且差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖2。

2.3 L428、L428-CD99、IM9、KM3 淋巴瘤細胞SHP1 和CD99蛋白表達Western blot 結果與m RNA基因表達水平相一致，IM9、KM3、L428-CD99 細胞中SHP1 表達較L428 細胞中高，且與CD99 的表達趨勢相一致。見圖3。

圖2 RT-PCR 檢測L428-CD99（L99）與L428 細胞株中SHP1 與CD99 m RNA的表達

圖3 Western blot 檢測IM9、KM3、L428、L428-CD99中SHP1 與CD99 的蛋白水平表達

圖4 在L428 細胞中熒光共聚焦檢測CD99 與SHP1 的表達

圖5 瞬時干擾CD99 后SHP1 在基因和蛋白水平的表達

2.4 L428 細胞CD99 與SHP1 的表達及其共定位 采用熒光共聚焦實驗在L428細胞中檢測CD 99與SHP 1的表達部位，同時對其進行共定位，結果顯示CD99 主要表達于細胞膜，SHP1 主要表達于細胞質，紫色為共定位部分。見圖4。

2.5 瞬時干擾CD99 后SHP1 在基因和蛋白水平的表達 在IM9 細胞中Si-RNA瞬時干擾CD99 后，用RT-PCR及Western blot 檢測SHP1 在基因和蛋白水平的表達。結果發現下調CD99 后，SHP1 m RNA表達降低（圖5A、B），且差異有統計學意義（P＜0.01）；蛋白水平表達趨勢與基因水平相一致（圖5C）。

3 討 論

SHP1 主要表達于造血細胞的細胞質，是調節細胞內磷酸化水平的關鍵調控因子，在多數淋巴瘤和白血病細胞系（如NK-YS2、IWA3、MT1、EDS、ATLIK等）中低表達，其啟動子高甲基化狀態導致的基因沉默是淋巴瘤、白血病發生、發展的重要機制之一［6-7］。相反，SHP1蛋白在正常細胞中可以表現為正常表達或過度表達。SHP1 調節機能障礙可導致細胞的過度增長，從而導致腫瘤的發生［8-9］。HL是一種淋巴造血系統的惡性腫瘤，1832年由英國的Thomas Hodgkin 最早描述，該疾病的典型形態特點是在大量的炎性反應背景細胞中浸潤少數的腫瘤性H／RS（hodgkin／reed-stern-berg）細 胞［5-10］。人CD99（Mic2）是一種相對分子質量為32 ×103的跨膜糖蛋白，是HL 的潛在致瘤基因，參與造血細胞的分化等。研究報道H／RS 細胞的形態特征及免疫表型的變化與CD99蛋白表達缺失有關，CD99 是HL 形成的一個重要機制［11］。本研究熒光共聚焦檢測也發現SHP1 為細胞質表達，CD99 為細胞膜表達，且二者有共定位部分。

Oka 等［12］通過表達譜芯片及組織微陣列技術證實SHP1基因在惡性淋巴瘤中表達明顯下降。本研究在轉錄和翻譯水平檢測3 株B 系淋巴細胞IM9、KM3、L428 中SHP1 的表達，結果顯示SHP1 在HL細胞株L428 中表達最低；與CD99 的基因和蛋白水平表達趨勢有一致性。

JAK／STAT信號轉導途徑參與細胞增殖、分化、凋亡生物學作用的相關調控。研究發現，該途徑異常激活是HL 形成的一個重要分子機制，但其異常激活的具體機制尚未完全明確［13-14］。SHP1 基因為存在于細胞質中的一種酪氨酸磷酸酶，是JAK／STAT信號轉導途徑負性調控因子之一。SHP1 基因沉默可以導致JAK／STAT信號轉導分子活性增強，從而促進腫瘤發生、發展。本研究在課題組前期構建的上調CD99 穩定細胞株L428-CD99 中同樣在轉錄和翻譯水平檢測SHP 1 基因和蛋白水平的表達，發現SHP1 隨著CD99 的上調而基因和蛋白水平表達升高。證實SHP1 在HL 中低表達可能與其CD99缺失有關，熒光共聚焦實驗以及在IM9細胞株中瞬時干擾CD99 時，均 發 現CD99與SHP 1有相互關系。而CD 99與SHP1 的相互關系是否與SHP1 基因表達下調從而導致JAK／STAT信號轉導途徑失調有關，有待于進一步研究。

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