大鼠面神經高位損傷后面神經核區磁共振波譜成像＊

李宗芳，張振光，龔霞蓉，田 偉，戴敏方，劉 流

（1.昆明醫科大學第一附屬醫院磁共振室，昆明650032；2.云南省第一人民醫院磁共振室，昆明650032；3.昆明醫科大學第一附屬醫院口腔頜面外科，昆明650032）

研究表明面神經高位損傷可導致面神經元的顯著凋亡［1-5］。以往研究凋亡采用的探測方法都為體外檢測法，這些方法通常需要處死動物，而對人體內器官組織的凋亡研究則具有創傷性。作為一種無創性研究活體組織器官代謝物水平變化的影像學方法，質子磁共振波譜成像（proton magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS）為面神經損傷后面神經元細胞凋亡的無創性檢測帶來了希望。本研究通過對正常大鼠和面神經高位損傷大鼠模型行面神經核區1H-MRS成像，并對照組織病理學改變，以期探討1H-MRS在面神經高位損傷后面神經元細胞凋亡的無創性檢測中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠40只，對照組20只，實驗組20只，體質量（200±10）g，由昆明醫學院實驗動物中心提供。分籠喂養于光照、黑暗均為12 h的恒溫環境，自由攝食和飲水。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2 大鼠面神經高位損傷模型的建立 參照文獻［4-5］，建立雙側面神經高位損傷模型，術后3 周行1H-MRS。具體方法：術前6 h 禁食，稱體質量后后經腹腔注射4%水合氯醛（1 m L／100 g）進行全麻。麻醉生效后取俯臥位固定，耳后溝縱行切開皮膚約2 cm，于腮腺后上緣暴露面神經主干，沿主干向上稍追蹤，在莖乳孔根部松解面神經并輕拉，使其被牽拉出約3 mm后切斷，造成面神經高位損傷，斷端腦側自然回縮入莖乳孔。說明：本方法是雙側面神經高位切斷。因為目前3.0T MRS雖在大鼠大腦可以做到單側采集并自體對照，但在橋腦水平，由于橋腦本身體積較小且MRS 最小感興趣區有限，在兼顧譜線質量的情況下，能達到的最小感興趣區中橋腦雙側都會被包含在內，所以目前還做不到單側采集，只有雙側高位切斷面神經，并與正常大鼠進行對比。本文中波譜采集的感興趣區可以從圖1A、B 中左上角的感興趣區定位圖中看到。

1.3 面神經麻痹評價 面癱的觀察包括瞬目反射和觸須運動［6］。瞬目反射的觀察是用5 m L注射器18 號針頭距離鼠眼3 cm瞬間吹風2 mL，比較雙側眨眼的速度和幅度進行評分：0分為雙側正常且對稱、1 分為減弱或延緩、2 分為消失。觸須運動的觀察是通過比較雙側觸須拂動的程度進行評分：0 分為雙側拂動正常且對稱、1 分為觸須拂動減弱、2 分為消失。將2 項指標的評分相加進行面癱的鑒定和評價（0，1 分為無面癱；2，3分為不完全面癱；4 分為完全性面癱）。

表1 對照組和實驗組面神經核區的1H-MRS 代謝物值的比較（±s，n＝20）

表1 對照組和實驗組面神經核區的1H-MRS 代謝物值的比較（±s，n＝20）

組別 NAA NAA／Cr Cho Cho／Cr對照組 10173．18 ±1500．331．27 ±0．146035．76 ±1357．420．76±0．19實驗組 7840．00 ±2671．460．94 ±0．335514．50 ±1801．510．66 ±0．22 t 3．1593．7820．9621．418 P 0．0030．0010．3430．165

1.4 MRI 及1H-MRS 掃描 采用GE 3.0T超導M R掃描儀（Signa HDxt）及大鼠專用動物線圈。大鼠經腹腔注射4%水合氯醛（1 mL／100 g）麻醉后，俯臥位固定。

常規MRI 掃描：采用快速自旋回波（fast spin echo，FSE）的T2WI 序列，以橋腦為中心進行軸位、矢位及冠位的掃描，目的是為1 H-MRS掃描提供定位像。掃描參數為：TR／TE：1140 ms／110 ms，視野：8.0 cm ×5.6cm，矩陣：320 ×256，激勵次數：3，層厚／間隔：2.0 mm／0.3 mm，回波鏈：10。

1 H-MRS 掃描：依據大鼠腦立體定位圖譜［7］，以第四腦室尖所對橋腦平面為中心（面神經核團最大層面），選擇1 感興趣區，取感興趣區時盡量避開周圍骨質、血管及腦脊液等，并在其周圍使用選擇性飽和帶。用點分辨波譜序列（point-resolved surface coil spectroscopy，PRESS），對所選擇的感興趣區自動完成體素內勻場、抑水，達到理想標準后開始1H-MRS 掃描。PRESS 序列參數：TR／TE：1000ms／144ms，矩陣：12 ×12，激勵次數：5，FOV：10 cm，掃描時間12 分4 秒。原始數據傳入工作站后使用Functool 4.5.5 軟件進行處理。在重建的波譜圖上，獲得波譜分析軟件自動計算出的各代謝物的值，包括N-乙酰天門冬氨酸（N-acetylaspartate，NAA）、膽堿（choline，Cho）、Cho，并以Cr 值為標準，計算NAA／Cr 和Cho／Cr 的值。

1.5 對照組與實驗組組大鼠面神經核的蘇木素-伊紅（HE）、甲胺苯藍（TB）和末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d UTP 原位切口末端標記（TUNEL）染色 于MR檢查后取對照組2 只與實驗組4 只大鼠行灌注、取材和切片。切片時取面神經根與副神經根之間腦干，依據大鼠腦立體定位圖譜［7］定位面神經核位置，然后以5μm層厚連續切片，每5 張取1 張切片進行貼片。共收集3 套切片，分別行HE、TB 和TUNEL 染色。

1.6 統計學處理 采用SPSS17.0 軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，2 組大鼠面神經核團腦組織的NAA、Cho、NAA／Cr 及Cho／Cr 指標之間的比較采用兩獨立樣本均數t 檢驗進行統計處理，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 面神經損傷大鼠模型的行為學觀察 術后所有動物進食、活動正常。術后1～3 周雙側觸須均集中伸直并向后伸展，完全不能抖動，瞬目反射消失，呈現完全性面癱，證實造模成功。

2.2 1H-MRS 檢測結果 實驗組NAA、NAA／Cr 較對照組降低且差異有統計學意義（P＜0.05），而Cho 及Cho／Cr 差異無統計學意義（P＞0.05），見表1，圖1、2。

圖1 2組1H-MRS 的感興趣區定位圖及波譜圖

圖2 2組面神經核病理學染色圖（×100）

2.3 2組大鼠面神經核的HE、TB 和TUNEL 染色 對照組，HE 染色：正常面神經元胞核呈淡紫色，細胞質為深紫色，神經元周圍分布著膠質細胞。TB 染色：與HE 染色比較，由于膠質細胞染色淺淡，面神經元染色更為明顯；高倍鏡下正常面神經元胞核呈淡藍色，核仁明顯、居中呈紫藍色，細胞質中尼氏體染色均勻呈紫藍色。TUNEL染色：正常面神經元胞核呈淡棕色，核仁和細胞質均為淡綠色，TUNEL陽性細胞為棕褐色，即凋亡細胞。由圖可知對照組大鼠面神經核中沒有或偶見單個凋亡細胞，見圖2A、B、C。實驗組，HE染色：大量神經元表現為細胞固縮，胞體收縮，呈類三角形，胞核收縮呈不規則形狀。沒有發現紅色神經元、鬼影細胞、衛星現象等神經元壞死的特異性改變，因此可以排除細胞壞死。TB 染色：大量神經元表現為細胞固縮，胞體收縮，呈類三角形，胞核收縮呈不規則形狀。TUNEL 染色：面神經核中見大量陽性細胞，見圖2A1、B1、C1。

3 討 論

3.1 面神經高位損傷后面神經元的凋亡 文獻報道，當面神經高位損傷后其胞體從靶器官獲取的神經營養因子減少，出現形態改變，并不可避免地引起一定數量的神經元細胞死亡，且其死亡方式以凋亡為主。Dai 等［2］、方澤強等［3］對大鼠面神經損傷后面神經核內神經元的變化進行了研究，認為面神經損傷后面神經核內的神經元在15 d 達到凋亡高峰。Park 等［4］對小鼠面神經高位損傷4 周時面神經核內神經元的數量進行了計數，研究認為損傷側的面神經核內神經元的數量僅有正常側的10%。而本實驗前期研究認為，面神經高位損傷后面神經核內的神經元在第3 周時較第2 周明顯［5］，所以本實驗選擇在造模后3 周行1H-MRS。

3.2 MR掃描儀在大鼠1 H-MRS 研究方面的應用 MRS 是1 種利用化學位移現象對特定原子核及化合物進行定量分析的功能性成像技術，在臨床癥狀出現之前即可早期無創傷性地測量活體腦組織內化合物的代謝變化。1H-MRS對NAA、Cho、Cr 這3 種化合物濃度的測量具有很好的可重復性和穩定性，可通過這些化合物濃度的變化反映腦內一些疾病的病理變化。由于大鼠的體質量相對于人體很小，需要更高的空間分辨率及信噪比，所以大鼠腦的1 H-MRS 在以往多使用4.7T及其以上場強的非臨床型MR掃描儀進行研究，國內外已有很多報導［8-11］。但隨著近年來1.5T及3.0T MR掃描儀在臨 床 上的推廣及軟硬件的提高，越來越多的研究者嘗試在臨床型MR掃描儀上進行大鼠動物模型的1H-MRS 研究。Dogan 等［12］在1.5TMR掃描儀上用1 H-MRS 技術來研究3G手機的電磁輻射對大鼠大腦的影響。Leib 等［13］在2.34T MR掃描儀上用1H-MRS 技術來研究丙戊酸鹽體內注射后活體大鼠腦內丙戊酸鹽的檢測。Ma 等［14］用1H-MRS 技術來研究在體和離體偏頭痛大鼠模型腦內代謝物濃度的變化，其中在體研究使用3.0T MR 掃描儀，離體研究使用14.7T MR掃描儀，二者的結果一致。上述研究證明在臨床型MR儀上用1H-MRS 技術無創性檢測一些大鼠模型腦內代謝物的變化是可行的，所以本實驗嘗試用3.0T MR掃描儀來研究1H-MRS 在面神經高位損傷后面神經元凋亡的無創性檢測中的應用價值，以期為將來的臨床應用奠定基礎。

3.3 NAA峰值的變化及意義 N A A是正常波譜中的最高峰，位于2.02 ppm處。NAA主要在中樞神經系統的神經元中出現，而不出現在神經膠質細胞或者是非神經細胞組織中，是神經元及其附屬物的特異性標記物，被稱為神經元的內標記物。NAA的含量可反映腦內神經元的數量、功能和神經元的完整性，在神經元喪失或者是受損時，其濃度下降。在1H-MRS 中，NAA含量或與其他代謝物的比值的減低，可作為神經元數量缺少和功能障礙的最佳指標［15］。Woo等［10］應用1 H-MRS 技術研究大鼠腦缺血模型腦內代謝物的變化，發現NAA／Cr 值在缺血再灌注后9h 時出現降低，同時TUNEL陽性細胞數量出現明顯增多。趙光明等［16］對三叉神經慢性疼痛的大鼠模型雙側丘腦進行1H-MRS 檢測，慢性疼痛致模型組丘腦區NAA／Cr 值較假手術組減少，表明1H-MRS 可以檢測出慢性疼痛狀態下丘腦神經元的受損情況。本實驗實驗組NAA、NAA／Cr 值較對照組降低，提示實驗組面神經核區神經元的含量較對照組減少，同時行為學檢測顯示大鼠呈完全性面癱，病理學顯示面神經核中大量TUNEL陽性細胞，表明1HMRS 的檢測結果與行為學表現和病理學結果一致，提示1HMRS 可以作為一種無創性評價面神經損傷后面神經核區神經元細胞凋亡的方法。

3.4 Cho 峰值的變化及意義 Cho 的波峰位于3.2 ppm處，是細胞膜磷脂代謝的主要成分之一，反映細胞膜的更新。Cho反映腦內總膽堿的儲藏量，包括游離膽堿、磷酸膽堿、磷脂酰膽堿和磷酸甘油膽堿等。Cho 與細胞膜磷脂的分解和合成有關，可反映細胞膜的穩定性和神經膠質的增生。Cho 峰增高提示細胞分裂增殖活躍，以及細胞膜代謝異常增高［17］。本實驗中對照組與實驗組Cho、Cho／Cr 比較差異無統計學意義（P＞0.05），這可能是因為面神經核區神經元細胞凋亡的同時，有大量的膠質細胞增生，抵消了神經元細胞凋亡引起的Cho 量的減少，從而導致Cho、Cho／Cr 無明顯變化［3］。關于Cho／Cr 的變化，目前未有明確的理論解釋，尚需進一步研究探討。

綜上，本研究應用1H-MRS 技術在大鼠活體上無創檢測了面神經損傷后面神經核區NAA、Cho、Cr 等物質的代謝改變，并與行為學表現及病理學檢測結果一致，提示1H-MRS 可以作為1 種無創性評價面神經損傷后面神經核區神經元細胞凋亡的方法，為將來的臨床應用奠定了基礎。

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