Wnt10b 肝細胞肝癌中的表達＊

浮鳳洲，范曉麗，孫 莉，△

（桂林醫學院臨床：1.醫學院；2.基礎醫學院，廣西桂林541004）

肝細胞肝癌（以下簡稱肝癌）是我國最常見的惡性腫瘤之一，具有高發病率和高病死率的特點，近年來其發病率呈增高趨勢。Wnt 通路由多種癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質組成，是一種與調節胚胎發育以及腫瘤發生發展相關的蛋白信號傳導通路［1］。Wnt 通路與腫瘤相關的研究已成為當前的研究熱點。Wnt 信號通路中與β-catenin 聚集密切相關的信號通路稱為經典Wnt 信號通路，除此以外的Wn t 信號通路稱為非經典Wnt 信號通路。Wnt10b 是Wnt 家族成員之一，由2.2 kb的m RNA編碼的389個氨基酸構成，相對分子質量為43 ×103。研究證實Wnt10b 通過經典途徑在腫瘤發生發展中發揮作用，并且在體外肝癌細胞株的研究中發現Wnt10b高表達［2］。本研究采用熒光定量PCR和Western blot 技術分別檢測33例肝癌組織及其對應癌旁組織中Wnt10b m RNA及蛋白的表達，初步探討Wnt10b 在肝癌中的表達規律及其與臨床病理參數之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集2012年6月至2013年5月桂林醫學院附屬醫院原發性肝細胞肝癌手術標本33對，按照C1、N1、C2、N2……C32、N32、C33、N33 編號，C代表癌組織，N代表癌旁組織。所有入組患者術前均未經放化療及其他抗癌治療。

1.1.2 試劑 RNAiso 試劑、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒均購自大連Takara 公司，BCA蛋白定量試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司，鼠抗人單克隆抗體及羊抗鼠IgG購自美國Aviva Systems Biology公 司，β-actin鼠 抗 人 單 克 隆 抗 體 購 自 美 國Santa Cruz 公司。引物均由Invi t rogen 公司合成。Wnt10b 正向引物：5′-TTG ATA CCC ACA ACC GCA AT-3′；Wnt10b 反向引物：5′-GTG CTC GCT CAC AGA AGT CAG G-3′，β-actin正向引物：5′-GGC ATC CTC ACC CTG AAG T-3′，β-actin 反向引物：5′-GGG ATA GCA CAG CCT GGA T-3′，

1.1.3 儀器 ABI 7500 FAST熒光定量PCR擴增儀，美國ABI 公司；紫外分光光度計，美國ABI 公司；電泳轉膜儀，北京六一儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 分離腫瘤及癌旁組織 手術標本切除后立即取材，避開腫瘤壞死與出血部位，無菌條件下取腫瘤組織及癌旁組織（用工具尺測量距瘤塊外緣3 cm以上）各2 塊，標本大小約1 cm ×1cm ×1 cm，一塊置于甲醛固定液中固定，制做組織切片并進行蘇木素-伊紅（HE）染色，邀2 名病理學專家對切片進行病理學鑒定，另一塊在組織離體后20 min 內置于液氮中速凍，然后儲存于-80 ℃冰箱，用于RNA和蛋白提取。

1.2.2 總R N A和蛋白的提取 取凍存的組織標本，每例組織標本稱取100 mg 加入1 m L RNAiso，在冰浴中進行勻漿處理，直至勻漿液呈顆粒無透明狀，向勻漿裂解液中加入0.2 m L的氯仿，蓋緊離心管蓋，用手猛烈振蕩15 s，待乳液充分乳化，無分相現象后，室溫靜置5 min，然后12000 r／min 4℃離心15 min，取出分相清楚的離心管，轉移上清液至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫靜置10 min，12000 r／min 4 ℃離心10 min，有沉淀析出，棄上清液，75%乙醇洗滌沉淀后小心棄去乙醇，室溫干燥沉淀5 min，加入0.04 m L焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解沉淀。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的均一性和完整性，用紫外分光光度計測定總RNA的純度和含量，A260／A280在1.8～2.0之間時，讀取RNA濃度。

1.2.3 cDNA合成 按PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒說明書分兩步進行cDNA合成，第一步：取總RNA 3.0μL，Oligo d T Primer 1.0μL，d NTP mixture 1.0 μL，RNase free d H2O 4.5μL，反應條件為42 ℃2 min；第二步：向第一步反應管中加5 ×PrimeScript Buffer 4.0μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，PrimeScript RTase 1.0 μL，RNase Free d H2O 4.5μL，反應條件為37 ℃15 min，85 ℃5 s。反應產物放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 熒光定量PCR采用SYBR法，使用ABI 7500 Fast Real Time PCR System進行PCR擴增和結果分析，反應體系：2 ×SYBR Premix Ex Taq TMⅡ10.0μL，上、下游引物各0.8 μL，50 ×ROX Reference DyeⅡ0.4μL，cDNA模板2μL，加去RNase 水至20μL。兩步法PCR擴增：95℃30 s；95℃3 s，60℃30 s，40個循環。每個樣品均作復管反應，重復3次，以DEPC 處理水作為陰性對照。所有樣品均在相同反應條件下進行Wnt10b m RNA檢測。采用2-△△CT法對擴增產物定量計算，△CT＝CTWnt10b-CTβ-actin，△△CT＝△CT 癌-△CT癌旁＝（CTwnt10b-CTβ-actin）癌-（CTWnt10b-CTβ-actin）癌旁。C代表Cycle（擴增循環數），T代表threshol ds（擴增域值），CT值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。

1.2.5 PCR產物測序 在CEQ8000 測序儀上進行PCR產物測序，以鑒定PCR產物特異性。

1.2.6 Western blot 檢測Wnt10b 蛋白的表達 分別提取肝癌和癌旁組織的總蛋白，經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，轉移電泳產物至硝酸纖維素膜上，于5%脫脂奶粉中室溫封閉1.5 h。加一抗（鼠抗人Wnt10b 單克隆抗體，1∶1500 稀釋），置于4℃冰箱反應過夜。TBST洗滌3遍，每次10 mi n，加二抗（羊抗鼠Ig G抗體，1∶1000 稀釋），室溫培育2 h，暗室發光。以鼠抗人β-actin單克隆抗體（1∶1500稀釋）作為內參照，Wnt10b 蛋白的相對表達量以Wnt10b／β-actin 灰度值比表示。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0 軟件對數據進行統計學處理，癌組織與癌旁組織比較采用配對t檢驗，Wnt10b mRNA表達與臨床病理參數間的比較采用兩樣本t檢驗，檢驗水準為α＝0.05，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HE染色鑒定組織病理特征 共收集標本33對，通過HE 染色，病理鑒定所有組織標本病理特征，高分化肝癌7 對，中分化肝癌17 對，低分化肝癌9 對，見圖1。

圖1 癌及癌旁組織病理學圖片（HE ×200）

2.2 組織總R N A提取及實時定量P C R采用Trizol 法提取組織總RNA，取產物5μL 上樣量于1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果可見18S 和28S 兩條清晰條帶，提示總RNA高質量提取成功。將RNA反轉錄后進行熒光定量PCR檢測，通過熒光定量PCR擴增曲線，產物到達平臺期，對融解曲線分析，可以看到單一的峰型，說明擴增產物有較高的特異性。PCR產物比較采用CT法定量，根據2-ΔΔCt值反映出Wnt10b 在不同樣本的表達水平，見圖2。

2.3 Wnt10b m RNA在肝癌及癌旁組織中的表達差異 將每個樣品的2-△△CT值作為觀察值，反映Wnt10bmRNA在33 對肝癌組織標本中的表達量，對Wnt10b mRNA在肝癌和癌旁組織中的2-△△CT進行配對t 檢驗，結果顯示：Wnt10b mRNA在肝癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

圖2 Wnt10b mRNA在肝癌及癌旁組織中的表達

2.4 Wnt10b 蛋白在肝癌及癌旁組織中的表達差異 Western blot 結果顯示：肝癌組織中Wnt10b 蛋白表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。Wnt10b 和βactin 灰度值見圖3。

2.5 肝癌組織中Wn t 10 bmRNA的表達與臨床病理參數的關系 肝癌組織中Wnt10b mRNA的表達與患者的年齡、性別、組織分化程度及臨床分期無關（P＞0.05），見表3。

表2 癌組織和癌旁組織中Wnt10b mRNA和 蛋白的表達（±s）

表2 癌組織和癌旁組織中Wnt10b mRNA和 蛋白的表達（±s）

a：P＜0.01，與癌旁組織比較。

組別 n mRNA 2-△△CT蛋白質癌組織 339.4441±7.6787a 0.2439±0.0826值a 335.3547±5.79050.1903±0.0936癌旁組織

圖3 Western blot 檢測Wnt10b 在肝癌及癌旁組織中蛋白的表達

表3 組織中Wnt10b 的表達與臨床病理參數的比較（±s）

表3 組織中Wnt10b 的表達與臨床病理參數的比較（±s）

P1：高分化組和中分化組比較；P2：中分化組和低分化組比較；P3高分化組和低分化組比較；P4：Ⅱ期和Ⅲ期比較；P5：Ⅲ期和Ⅳ期比較；P6：Ⅱ期和Ⅳ期比較。

項目 n Wnt10b mRNA 2-△△CT 值P 0.6703 男 229.0325±7.7348 女 1110.2672±7.8693年齡 0.9465 ＜60 歲 209.5181±8.5656 ≥60 歲 139.3301±6.4064分化程度 高 78.9668±8.54420.9730（P1） 中 179.0941±8.17660.6685（P2） 低 910.4763±6.76230.6986（P3）臨床分期 Ⅱ 108.3789±5.86620.5679（P4） Ⅲ 1510.2817±8.18100.7207（P5） Ⅳ 89.0398±8.74130.8572（P6）性別

3 討 論

Wnt 經典信號通路在調節組織器官的生成、增殖和分化，以及維持機體穩態中起重要作用［3］。經典Wnt 信號通路的構成和激活機制的研究已相對完善，人們認識到經典Wnt 信號通路并不僅是一條單純的線性信號傳導通路，而是一條多基因參與，擁有多個作用位點的相對開放的信號途徑，參與該途徑的蛋白及其作用機制相對復雜。Wnt 蛋白是Wnt 基因編碼的分泌性蛋白，屬于經典途徑的有：Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、Wnt10b［2］。之前的研究表明Wnt 經典信號通路參與了消化系統腫瘤和女性生殖系統腫瘤的形成。研究證實，Wnt2 在食管細胞癌中通過激活經典信號通路，促進食管癌細胞的生長［4］；據報道，Wnt1［5］、Wnt2［6］在胃癌組織中異常表達。趙玉潔等［7］研究發現Wnt3a 在正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變組織及宮頸鱗癌組織中的表達逐漸升高，可能參與了宮頸鱗狀上皮的惡性轉化過程，促進宮頸上皮內瘤變向宮頸鱗癌轉化。另研究發現，Wnt10a 高表達時，腎癌細胞株的β連環蛋白（β-catenin）聚集、細胞周期素D1（cyclin D1）與禽類髓細胞病毒致癌基因同系物（c-myc）表達增加［8］，而當Wnt10b的表達被抑制后，細胞內的β-catenin 聚集減少，cyclin D1 與cmyc 表達下降，同時也導致細胞增殖、遷移、侵襲力等下降［9］。

研究表明，Wnt 經典信號通路各蛋白表達水平的改變及相關基因的突變參與了原發性肝癌的發生發展［10-12］。30%～70%的肝癌中發現Wnt 經典通路關鍵因子β-catenin 在胞內聚集［13］。Wei 等［14］發現Wnt1 在肝癌組織及其細胞系中表達增高，Wnt1 蛋白抗體能夠降低肝癌細胞系Huh7 和Hep40 的增生及生存能力，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制經典Wnt 信號通路，而對正常肝細胞生長無影響。同樣有研究認為Wnt1 可以作為一個重要指標預測肝癌術后復發［15］。Yoshikawa 等［16］發現7／10 的肝癌和1／2 的結腸癌細胞株表達大量的Wnt10b mRNA。Yuzugullu 等［2］研究發現在高分化和低分化的11 種肝癌細胞系中Wnt3 和Wnt10b 均表達上調。因此，Wnt10b 的異常表達參與了肝癌的發生，可能扮演著一個重要角色。本文從臨床肝癌組織著手，運用熒光定量PCR技術和Western blot 技術，對肝癌組織中Wnt10b 基因轉錄和蛋白水平進行相對準確的定量檢測和分析，敏感性和特異性較高。通過分析肝癌組織和癌旁組織中Wnt10b 基因和蛋白的表達變化規律，以研究Wnt10b 在肝癌發生發展中的作用。

研究結果示，Wnt10b mRNA及蛋白在肝癌組織中表達水平高于癌旁組織，研究結果與Yuzugullu 等［2］的一致，由結果可見Wnt10b 基因和蛋白表達趨勢呈現出一致性，作者分析Wnt10b 表達的上調可能是在基因轉錄水平，而Wn t 10b 在肝癌組織的異常高表達提示，Wnt10b 可能在肝癌的發生發展過程中發揮著癌基因樣的作用，在正常肝細胞向癌細胞轉化過程中起著正向促進作用，而非抑制作用。而Wnt10b m RNA和蛋白的表達與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度及臨床分期無關，作者分析可能存在以下4 方面原因：（1）樣本含量小、存在樣本選擇偏倚和信息偏倚；（2）以及RT-PCR和Western blot 結果出現假陽性；（3）人體組織中基因和蛋白表達的個體差異比較大；（4）肝癌的發生發展是一系列基因和蛋白的參與，存在著多種信息傳導通路異常傳導的病理過程，Wnt10b 對于肝癌不是一個絕對獨立的因素，只是整個肝癌信號網絡中的一個點。根據Wnt 信號通路的傳導機制，Wn t 10b 在整個Wn t 信號通路傳導過程中的啟動階段發揮重要作用，從Wnt10b 的異常表達到一系列靶基因的激活則可能受多種因子和信號通路的調節，而非簡單的線性傳導。作者認為，進一步研究Wnt10b 下游靶基因的作用機制，探明Wnt10b 介導的整條Wnt 信號通路中的各個環節以及尋找通路中抑制腫瘤細胞增殖的關鍵靶點十分重要。故本課題下一階段將進行Wnt10b 在肝癌中下游靶基因的作用機制的研究，以及利用構建慢病毒載體和基因干擾技術探討Wnt10b 基因沉默后對肝癌細胞株的影響。

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