人乳鐵蛋白對關節軟骨細胞增殖和細胞外蛋白激酶表達的作用

王卒平，劉啟蒙，張冬青，況 勇

（重慶醫藥高等專科學校 404100）

骨關節炎（osteoart hritis，OA）是一種常見的老年外科疾病，其主要臨床表現為關節軟組織的變性、破壞以及骨質增生，常引起老年患者關節疼痛，嚴重時影響其日常行動，使老年患者的生命質量嚴重下降。OA在臨床上的治療目前仍是一個難題，一般患者病情發展到終末期需行關節置換術，手術的創傷和經濟負擔常給患者及其家庭帶來巨大壓力［1］。而除了手術之外更加行之有效的藥物治療尚不明確，本文通過探討人乳鐵蛋白（h LF）在OA軟骨細胞外蛋白激酶（ERK）表達與促進細胞增殖和活力中的作用，旨在為臨床治療OA，尤其是早期藥物治療提供新的治療方向，現報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 8例OA患者，其中男6例，女2例，年齡55～65歲，平均（59．79±7．91）歲。所有患者均經過重慶醫藥高等專科學校相關實習醫院骨外科的相關檢查和診斷，根據中華醫學會骨科分會《骨關節炎診治指南（2007年版）》明確診斷為OA［2］。所有患者均在本院行關節置換術，將軟骨組織取下，置入脫酶處理的EP管，液氮轉移至-80℃冰箱保存備用。選取患者的軟骨組織進行人關節軟骨細胞分離和體外培養。上述試驗經過醫學倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。試驗所用材料如下：h LF（英國Sig ma公司生產），Ⅱ型膠原酶（英國Paisley公司生產），胎牛血清（FBS）（英國Biowest公司生產），LIVE／DEAD試劑盒（荷蘭Molecular Probes公司生產），All Prep DNA／RNA／Protein試劑盒（英國Qiagen Lld公司生產），DNA轉錄試劑盒（美國Applied Biosystems公司生產），i Cycler（英國Bio-Rad Labora-tories Ltd公司生產），噻唑藍（MTT）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）均由美國Cambrex Bioseience公司生產，ERK、磷酸化ERK抗體和熒光標記二抗均由英國R＆D公司生產。

1．2 方法 取直徑為1 mm，厚度為1 mm的人關節軟骨組織，用Ⅱ型膠原酶進行消化，濃度為300 U／mL，于37℃水浴中震蕩（75 r／min），消化時間為16 h。取胰蛋白酶與EDTA液配制而成的消化液加入FBS培養液進行培養，至原代細胞生長超過瓶底80%時，加入胰蛋白酶消化液，傳代培養，取第2代體外培養細胞進行試驗。將體外培養關節軟骨細胞培養液接種于96孔培養板上，培養24 h后分別加入12．5、25．0、50．0、100．0、200．0 mg／L的h LF。并設置空白對照組，即h LF濃度為0。每組設6個復孔，培養后離心取細胞液用MTT法檢測關節軟骨細胞的增殖力，用LIVE／DEAD染色檢測h LF對關節軟骨細胞活力的影響，用實時定量PCR（RT-PCR）檢測ERK mRNA的表達［3］。

1．3 統計學處理 采用SPSS15．0軟件進行統計分析，計量數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，多個樣本之間的比較采用One-Way ANOVA方差分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

通過MTT法檢測關節軟骨細胞的增殖力，結果顯示h LF對人關節軟骨細胞的增殖力具有促進作用，且具有顯著的濃度依賴性，差異有統計學意義（P＜0．05），見表1。用LIVE／DEAD染色檢測關節軟骨細胞的活力，結果顯示h LF對人關節軟骨細胞的活力具有促進作用，差異有統計學意義（P＜0．05），見表2、圖1。通過RT-PCR檢測ERK mRNA的表達，結果顯示h LF能增加人關節軟骨細胞的ERK mRNA的表達，差異有統計學意義（P＜0．05），見表3。

表1 h LF對人關節軟骨細胞增殖力的影響

表2 h LF對人關節軟骨細胞活力的影響（±s，%）

組別 樣本例數 關節軟骨細胞存活細胞比率對照組16 83．71±5．73試驗組16 99．52±3．85

圖1 h LF對關節軟骨細胞活力的促進作用（LIVE／DEAD染色×20）

表3 h LF對人關節軟骨細胞的ERK mRNA 表達影響（±s）

表3 h LF對人關節軟骨細胞的ERK mRNA 表達影響（±s）

組別 樣本例數 ERK mRNA 相對表達量對照組16 1．013±0．021試驗組16 1．764±0．123

3 討 論

OA是一種常見的老年慢性骨科疾病，其具體的發病機制尚未闡明清楚，主要表現為關節軟組織的變性、破壞及骨質增生等病理性改變，是引發老年人關節疼痛的常見原因之一，嚴重時可影響其日常行動，降低老年患者的生存質量［4］。一般患者病情發展到終末期導致患者行動受限，則需行關節置換術，而早期積極的藥物治療研究仍未取得重大的進展和突破［5］。OA是一個復雜的發病過程，傳統觀點認為軟骨基質的合成和降解失衡造成軟骨細胞肥大變化、終末分化直至礦化等變化過程，軟骨細胞合成分泌的蛋白多糖和膠原類型也隨之發生改變，同時產生一定的增殖能力，進而導致OA發病［6］。但近年研究顯示：絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）-ERK1／2信號通路在OA軟骨細胞中的表達水平明顯上調，且在軟骨組織中也存在顯著上調趨勢，表明ERK1／2在調控OA軟骨細胞病理改變中起到重要作用［7］。而MAPK在關節軟骨的退變和OA的病程中發揮了重要作用，其磷酸化可能是軟骨細胞受到刺激后的早期事件［8］。因此調節人類關節軟骨退變中的MAPK信號轉導通路，對OA的治療具有重要意義。

軟骨細胞是軟骨組織中惟一的細胞，在合成和分解膠原、蛋白聚糖等細胞外基質中以及維持軟骨組織相關功能方面具有重要的作用［9］。經過相關的病理檢查可以發現，OA患者的軟骨細胞發生了一系列的病理改變，包括肥大、增生、礦化等，使其正常的生理功能也發生了改變，導致軟骨增生，引發病變［10］。而h LF是一種天然的具有免疫功能的多功能蛋白質，其主要生理功能包括抗氧化、抗感染、抗癌等調節免疫系統的功能［11］。近些年的研究顯示h LF還表現出調控細胞增殖的功能，所以本文以此為線索，展開h LF對人關節軟骨細胞增殖力及活力影響的探究［12］。

本試驗表明，（1）h LF對人關節軟骨細胞的增殖力具有促進作用，且具有顯著的濃度依賴性，說明h LF通過顯著促進關節軟骨細胞的增殖力，可能在OA患者軟骨的修復中起到重要作用。（2）h LF對關節軟骨細胞的活力具有促進作用。（3）h LF能增加關節軟骨細胞的ERK mRNA的表達，已知ERK屬于MAPK家族中的一個亞族，由ERK1和ERK2兩種異構體組成，在軟骨細胞增殖、凋亡、轉化、分化中有重要作用，可以促進軟骨細胞中Ⅱ型膠原、整合素β1和軟骨蛋白多糖的表達。本文研究提示h LF可能通過上調ERK基因表達而促進關節軟骨細胞的增殖，進而在OA的治療中起到重要作用。

綜上所述，h LF能夠上調ERK mRNA的表達，促進關節軟骨細胞的增殖力與活力。臨床上可以此為線索進一步研究OA的發病機制，尋找更有效的治療方法。

［1］涂意輝，薛華明，夏志道，等．乳鐵蛋白對骨關節炎軟骨細胞增殖活力及細胞外調節蛋白激酶表達的影響［J］．中華實驗外科雜志，2012，29（7）：1242-1244．

［2］郝鋒，林劍浩．解讀《骨關節炎診治指南（2007年版）》［J］．中國臨床醫生，2010，38（7）：69-71．

［3］程亮，趙洪海，曾國慶，等．Akt與ERK1／2在人骨關節炎軟骨細胞中的表達［J］．中國病理生理雜志，2012，28（5）：889-894．

［4］封麗，鄧大平．乳鐵蛋白的生理功能及研究進展［J］．中國輻射衛生，2012，21（1）：121-124．

［5］張文賢，王小燕，馮康虎，等．創傷性骨關節炎軟骨細胞損壞與修復機制［J］．中國組織工程研究，2012，16（46）：8727-8732．

［6］馬鋼，任明姬．骨性關節炎軟骨細胞凋亡的研究［J］．中國組織化學與細胞化學雜志，2012，21（2）：196-200．

［7］Pierce A，Legrand D，Mazurier J．Lactoferrin：a multifunctional protein［J］．Med Sci（Paris），2009，25（3）：361-369．

［8］Prasadam I，Friis T，Shi W，et al．Osteoarthritic cartilagechondrocytes alter subchondral bone osteoblast differentiation via MAPK signalling pathway involving ERK1／2［J］．Bone，2010，46（1）：226-235．

［9］馬春輝，閻作勤，郭常安，等．Ⅱ型膠原與Bcl-2在骨關節炎軟骨細胞中的表達［J］．中國矯形外科雜志，2012，20（19）：1786-1789．

［10］Wang X，Li F，Fan C，et al．Effects and relationship of ERK1and ERK2 in interleukin-1β-induced alterations in MMP3，MMP13，typeⅡcollagen and aggrecan expression in human chondrocytes［J］．Int J Mol Med，2011，27（4）：583-589．

［11］Zhang W，Nuki G，Moskowitz RW，et al．OARSI recommendations for the management of hip and knee osteoarthritis：partⅢ：Changes in evidence following systematiccumulative update of research published through January2009［J］．Osteoarthritis Cartilage，2010，18（4）：476-499．

［12］Hayashi S，Nishiyama T，Miura Y，et al．DcR3 inducescell proliferation through MAPK signaling in chondrocytes of osteoarthritis［J］．Osteoarthritis Cartilage，2011，19（7）：903-910．