腫瘤相關巨噬細胞在多發性骨髓瘤發病機制中的作用＊

陳芯儀，孫瑞雪，吳 俁

（四川大學華西醫院血液科，四川 成都610041）

多發性骨髓瘤（MM）是來源于終末分化的B淋巴細胞的惡性腫瘤，以患者骨髓中大量漿細胞的克隆性增生為顯著特征。骨髓微環境在MM細胞的生存、增殖、遷移和耐藥中具有重要作用，并且直接影響疾病的臨床表現和預后［1］。在骨髓微環境中，各種細胞、細胞因子、細胞外基質以及細胞內外的信號分子形成一個功能齊備的整體，共同控制著干細胞的自我更新、分化、移動等復雜精細的過程。維持骨髓微環境的穩態是保證人類正常生命活動的必須條件［2］。骨髓基質細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是骨髓微環境中支持MM細胞生長、增殖和介導骨質破壞的關鍵細胞成分，而在基質細胞中，炎性細胞在疾病的進展中又起著不可替代的作用，巨噬細胞是炎性細胞之一。巨噬細胞在炎性組織中主要參與組織重建、炎癥和免疫，保護機體對抗感染及損傷，在某些特定的細胞因子作用下向腫瘤微環境定向移動，分化為腫瘤相關巨噬細胞（TAMs），參與腫瘤的生存、增殖、浸潤、轉移并與預后不良相關。

1 多發性骨髓瘤的發病機制

MM存在多步驟、多階段的復雜發病機制，近年來主要集中在細胞遺傳學異常、分子生物學以及骨髓微環境與骨髓瘤細胞相互作用等幾方面的研究。

1．1 MM的細胞遺傳學和分子生物學異常 研究表明，在MM的發病機制中，染色體異常有著重要的意義，包括數目異常和結構異常。90%的多發性骨髓瘤患者體內均可檢測出染色體數目異常，超過一半為超二倍體，最常見的染色體改變是＋3，＋5，＋7，＋9，＋11等，非超二倍體中最常見的是－8（8號染色體單體），－13，－14，－16，－17，－22。MM 染色體結構的異常可見于所有染色體，染色體結構異常最常見的是累及14q32（免疫球蛋白重鏈基因，IgH）的染色體易位，例如t（4，14），（14，16），t（14，20）等。IgH 易位常導致癌基因與IgH啟動子或增強子毗鄰，在IgH啟動子或增強子的控制之下表達失控，產生疾病表型［3，4］。

二代測序技術和外顯子測序發現骨髓瘤中缺乏統一的體細胞突變。最常見的突變為NRAS（23%）和KRAS（26%），其次為 FAM46C（13%）和 TP53（8%）［5］，NRAS和 KRAS突變基礎上附加 BRAF突變（4%）。在至少53%的骨髓瘤中ERK途徑至關重要，該途徑提供了一項迄今未被采用的治療策略。隨著測序樣本數量的增加，可能鑒定出靶向治療相關功能或信號通路的基因。例如，DNA和組蛋白甲基化是骨髓瘤中非常重要的生物學過程，它以t（4；14）骨髓瘤中組蛋白甲基轉移酶MMSET過表達為特點，同時也存在其它甲基轉移酶的突變，如EZH2和MLL3。此外，組蛋白賴氨酸脫甲基酶，如KDM6A（也稱為UTX）在骨髓瘤中也能檢出缺失或發生突變，這些使得組蛋白甲基化成為藥物治療的共同靶點。

1．2 骨髓微環境與骨髓瘤細胞的相互作用 研究表明骨髓瘤細胞的生長、存活及耐藥的產生與骨髓微環境密切相關。骨髓瘤細胞定位于骨髓微環境后，通過瘤細胞和BMSCs的黏附觸發了白細胞介素－6（IL－6）、血管內皮生長因子（VEGF）、腫瘤壞死因子（TNFA）、轉化生長因子B（TGF－β）等多種細胞因子的轉錄和分泌，它們互相促進分泌，形成龐大網絡，與骨髓瘤細胞的增殖、生存、耐藥及骨髓瘤骨病的發生有密切關系，還促進血管的生成［6］。

IL－6是MM最主要的通過自分泌和旁分泌產生的生長因子，目前認為是促進MM細胞生長和生存的關鍵性細胞因子。已證實部分MM細胞可自分泌IL－6，但骨髓環境中的IL－6主要來自BMSCs，在 MM細胞的增殖、凋亡，溶骨性改變及骨髓微環境中血管新生及耐藥等方面發揮重要作用［7，8］。IL－6活化 RAS依賴的MAPKL級聯信號途徑刺激瘤細胞的生長，活化JAK－STAT途徑維持瘤細胞生存；體外實驗證實IL－6可阻止皮質類固醇激素、血清starvation和Fas效應誘導的瘤細胞凋亡，提高瘤細胞的生存能力［9］。VEGF是目前發現的作用最強、特異性最高的促血管生成因子 ，研究發現，MM細胞不僅表達VEGF而且表達其受體，在MM中，由于VEGFR在多種細胞表面表達，導致了VEGF作用的多樣性。除刺激血管新生外，VEGF可刺激骨髓瘤細胞在纖維結合蛋白上遷移、增殖和存活，影響造血細胞的分化；增加B細胞的產生和髓系細胞的增殖；增加破骨細胞活性；抑制樹突狀細胞成熟等［10］。MM病理生理機制中也涉及一些其他重要的細胞因子，它們通過不同的機制或作用于不同的環節共同促進了MM的發生與發展。骨髓微環境中，除細胞因子之間相互影響，還包括內皮細胞、破骨細胞等細胞成分也可相互影響。

2 TAMs概況

2．1 巨噬細胞功能 巨噬細胞來自于血液中的單核細胞，而單核細胞是由骨髓中的粒－單系祖細胞分化發育而成，以不成熟的形式從骨髓中釋放入血，然后從循環血遷移至組織 ，并在組織中進一步發育成熟，分化成巨噬細胞。巨噬細胞存在于機體中幾乎所有的組織并得以不同的名稱，包括肝臟的kuffer cell、肺臟的肺泡巨噬細胞等，在局部微環境的作用下，巨噬細胞獲得其特殊表型特征［11］。巨噬細胞吞噬微生物和呈遞抗原至T細胞，從而構成防御病原體入侵的第一道防線。還可通過多種細胞因子、趨化因子、蛋白水解酶和清道夫受體的表達來調控組織生長、平衡、修復和重塑。巨噬細胞組成一個極大的異質性群體，且功能活性又不盡相同，有些功能甚至是互為相反的，例如巨噬細胞既可促進炎癥亦可抑制炎癥；既具有免疫原性又可誘導免疫耐受；既導致組織破壞又有助于組織修復。

2．2 巨噬細胞表型的異質性 巨噬細胞復雜多變的表型是由其在組織中的不同定位及激活狀態決定的，巨噬細胞在不同的刺激信號和調節性細胞因子的刺激下發生不同性質的活化，從而產生兩種不同的類型，包括M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞［12］。細菌及其產物和機體分泌的干擾素－γ（IFN－γ）、腫瘤壞死因子（TNF）均可刺激巨噬細胞表達M1表型，M1型巨噬細胞具有較高的抗原提呈能力，大量分泌促炎性細胞因子如白細胞介素－1（IL－1），IL－6，IL－12，IL－23以及一氧化氮（NO）等，所以M1被認為具有促進炎癥反應和抑制腫瘤的能力［13］。誘導巨噬細胞向M2型分化的因子包括Th2細胞分泌的IL－4、IL－13等，每一特定的因子均可誘導巨噬細胞發生獨特的表型變化［14］。M2型巨噬細胞高表達抗炎細胞因子IL－4、IL－10、IL－13等，較低的表達促炎細胞因子；常高表達細胞表面清道夫受體，如甘露糖受體（MRC1／CD206）及血紅蛋白／結合珠蛋白清道夫受體（CD163）。M2巨噬細胞被認為具有對抗炎癥和促進腫瘤的能力［15］。但是，需要注意的是，這樣分類并不絕對，在一定條件下，M1與M2呈動態變化，并且可以相互轉化的。

2．3 TAMs與腫瘤 巨噬細胞參與腫瘤的發生發展，巨噬細胞不同極化類型對腫瘤的作用不同。M1型通過多種途徑殺傷腫瘤細胞，而M2型卻參與了腫瘤的發生生長侵襲和轉移的過程，促進腫瘤細胞生長，腫瘤血管生成以及腫瘤細胞遷移等作用［16］。腫瘤局部微環境使腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）向M2型巨噬細胞分化，有研究［17］認為TAMs在腫瘤的起始階段表現為M1型，進展階段則表現為M2型。大量研究顯示，存在于腫瘤組織中的TAMs大部分表現出M2的表型，且與腫瘤的治療和預后密切相關研究表明。腫瘤相關巨噬細胞促進腫瘤生長的機制大多是對實體瘤的研究建立，研究顯示［18～21］TAMs的廣泛浸潤與乳腺癌、腎癌及膀胱癌等的不良預后相關，在前列腺癌、肺癌及腦腫瘤中的作用尚有爭議。最近對于TAMs在血液系統腫瘤中作用的研究達到一個巔峰。在大多數淋巴瘤中，，高巨噬細胞浸潤與不良預后相關，這種相關性在霍奇金淋巴瘤中更突出，而在非霍奇金淋巴瘤不明顯［22，23］。而非霍奇金淋巴瘤中，研究顯示［24］血管免疫母T細胞淋巴瘤中M2型的高表達與其不良預后相關。

3 腫瘤相關巨噬細胞在多發性骨髓瘤發病中的作用

3．1 腫瘤的生長和轉移的機制 證據顯示，骨髓瘤相關的巨噬細胞來源于招募的單核細胞，而不是來自骨髓的單核細胞前體［25］。一旦單核細胞招募到早期腫瘤的微環境中，單核細胞可能會活化為M1。早期病灶內巨噬細胞活化可能是多因素的：骨髓瘤細胞分泌炎性因子，促進巨噬細胞活化［25］；腫瘤擴散導致的局部組織破壞可能誘發或者增強先天免疫反應和適應性炎癥反應；骨髓瘤微環境構成了局部的微小炎癥，既促進骨髓瘤細胞表達Toll樣受體，又促使骨髓瘤細胞對Toll樣受體應答．Toll樣受體是一種模式識別受體，既可以結合外源性配體（比如特異識別病原微生物進化中保守的抗原分子，即pathogen－associated molecular patterns（PAMPS），病原相關分子模式）也可結合內源性配體（例如常見的來自宿主細胞，如熱休克蛋白，在細胞應激或組織損傷時產生細胞外基質降解成分等。Toll樣受體結合各種配體通過不同的信號通路激活的癌基因和及其產物可導致強效的促炎反應［27，28］。活化的癌基因（尤其是RAS等）或者癌基因產物（融合蛋白）也可以直接誘發促炎反應。通過上述不同信號刺激途徑，巨噬細胞活化增強促炎因子的合成和分泌，如 TNFα，IL－1β，IL－6，IL－8等，這些因子可促進惡性細胞的生長、遺傳的不穩定性及惡性細胞的克隆演變等［29］，隨著腫瘤的生長及進展，選擇壓力誘導巨噬細胞向 M2型分化［29］。在不同腫瘤類型，腫瘤不同部位，M1和M2的表型都不是絕對的，往往存動態變化。

有研究表明，巨噬細胞具有殺瘤的內在潛力，這是不利于惡性漿細胞生長的。但事實上，骨髓瘤細胞可上調整合素相關受體蛋白的表達，即CD47。CD47則通過與骨髓瘤相關巨噬細胞表面的信號調節蛋白α（SIRPa）相互作用，產生強效的抗吞噬信號［30］。絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen－activated protein kinase8，MAP3K8），又稱為腫瘤進展位點2（tumor progressionlocus2，TPL2），為一種絲／蘇氨酸激酶，在固有免疫應答及巨噬細胞的細胞因子分泌方面起重要作用，可調控多種信號轉導通路，并維持多種抗炎及促炎因子的平衡［31，32］。TPL2的促炎或是抗炎是組織及環境特異的。研究數據［33］表明骨髓瘤相關細胞的TPL2依賴的抗炎或促炎通路是構成性激活，TPL2激酶通過腫瘤細胞自主和非自主機制調節骨髓瘤的增長，TPL2是骨髓瘤相關巨噬細胞分泌細胞因子的關鍵調節因子。巨噬細胞通過與腫瘤細胞的接觸與非接觸機制促進瘤細胞的生存。巨噬細胞是骨髓瘤微環境中的一種重要成分，通過巨噬細胞和腫瘤細胞之間的相互作用從而激活信號通路保護瘤細胞免于藥物誘導的凋亡。研究發現巨噬細胞能夠通過抑制細胞凋亡蛋白酶途徑來阻斷藥物誘導的瘤細胞凋亡，尤其是細胞凋亡蛋白酶3和多聚（ADP－核糖）聚合酶（PARP）［34］。據觀察，巨噬細胞介導的防止骨髓瘤細胞系或是原代骨髓瘤細胞凋亡均需要細胞與細胞之間的直接接觸。其機制可能為骨髓瘤細胞上的P－選擇素糖蛋白配體1（PSGL－1）、細胞間粘附分子1（ICAM－1）分別和和巨噬細胞上的 E／P選擇素和CD18之間的相互作用，刺激了SRC，ERK1／2激酶和c－MYC，并抑制了藥物誘導的細胞凋亡蛋白酶的激活，使巨噬細胞保護骨髓瘤細胞免于藥物誘導的凋亡［35］。

巨噬細胞和破骨細胞屬同一造血細胞譜系，并且可以支持骨髓瘤細胞生存和發展，可通過共同的分子機制（促炎細胞因子和生長因子的產物），保護骨髓瘤細胞免于藥物誘導的凋亡［36］。這說明，定位于局部骨損部位且接近于骨表面的瘤細胞可受巨噬細胞的保護，位于骨髓內的瘤細胞也可能受到巨噬細胞的保護。破骨細胞和巨噬細胞也可以在骨髓瘤病灶通過共同途徑誘導血管新生［37］。近年發現［38］，一類與骨表面具有相關性的巨噬細胞亞群稱為骨性巨噬細胞，可能參與骨的重塑及局部免疫監視，但在骨髓瘤龕和骨髓瘤骨病中的發病機制還需要進一步研究。

3．2 血管生成 骨髓瘤是高度血管化的腫瘤，且血管密度的增加與疾病預后不良相關。骨髓瘤骨髓中微血管密度與CD163陽性巨噬細胞具有相關性，而CDl63僅表達于M2巨噬細胞［39］。因此，在多發性骨髓瘤中，巨噬細胞可能在"血管生成開關"中起重要的協調作用［40］。巨噬細胞也可通過細胞因子的分泌和血管網絡的生成以促進血管生成。其誘導血管生成的主要機制是通過在腫瘤中血管生長不良的區域分泌血管內皮生長因子A（VEGF－A）［41］。當骨髓瘤病灶擴大時，瘤細胞和基質細胞之間的旁分泌通路確保了強大的血管新生：巨噬細胞分泌的VEGF促進骨髓瘤細胞的生長和血管生成，導致骨髓瘤細胞不斷的分泌可直接促進血管生成的VEGF－A和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），也誘導間質細胞分泌VEGF－C和－D，通過與 VEGFR－3結合刺激骨髓瘤細胞的生長［42］。此外，活化巨噬細胞合成一氧化氮，能導致血管擴張，增強血管生成［43］。最后，巨噬細胞分泌的血管生成因子可刺激肥大細胞遷移，而肥大細胞也可促進血管生成［44］。Vacca和 Ribatti［45］等的研究表明，巨噬細胞通過"血管生成擬態"促進MM血管網的形成；Scavelli［46］等也提出，骨髓巨噬細胞受 VEGF 和bFGF刺激而活化后，可獲得一種血管內皮樣表型，這種能力與漿細胞腫瘤的進展水平相一致，這在正常人和非活動性MM和MGUS患者中是不存在的。

3．3 巨噬細胞在骨髓瘤治療中的地位 近十年來，多發性骨髓瘤不斷有新療法的問世，除了細胞毒性藥物化療，還包括高劑量化療后自體干細胞移植，蛋白酶體抑制劑和免疫調節劑（沙利度胺，來那度胺），這些方法為許多骨髓瘤病人延長了生存期，多發性骨髓瘤的治療主要是采取通過直接抗增殖對腫瘤細胞的影響［47］。盡管傳統的和新型制劑的成功，骨髓瘤仍然幾乎無法治愈。目前的治療方法，包括自體移植在內，在大多數患者中也不能治愈該病，甚至在同種異體移植后，復發也是常見的。據推測［48］這種持續嵌套在具有腫瘤保護性作用的壁龕內殘留的腫瘤細胞構成了主要復發機制，巨噬細胞 －腫瘤細胞的相互作用是維持骨髓瘤龕的動態平衡的關鍵因素。因此，靶向治療可克服目前的治療方法的局限性，也有治愈該病的可能性。沙利度胺等免疫調節劑的體內作用機制尚不清楚，LPS誘導的單核細胞產生TNF－α的體外研究發現，沙利度胺和它的類似物具有非常強烈抑制TNF－α產生的作用，提示沙利度胺及其類似物可能直接參與骨髓瘤相關巨噬細胞的活化或者極化。

可以根據巨噬細胞導致骨髓瘤發生發展的機制設想利用骨髓龕中巨噬細胞活化及其功能的方法來治療骨髓瘤［49］：①通過M1極化信號分子，例如CD40激動劑抗體，對巨噬細胞重編程使其保持M1表型。②通過抑制IL－10和阻斷TPL2，干擾M1向M2轉化的信號分子。③通過抗CD47抗體抑制骨髓瘤細胞的保護性信號，對瘤細胞和巨噬細胞相互作用的抑制從而增強殺瘤細胞效應。④通過干擾MAP3K8的活性可以阻斷骨髓瘤龕位中巨噬細胞和腫瘤細胞之間的相互作用。⑤干擾骨髓微環境中單核細胞的募集或選擇性消耗的腫瘤相關巨噬細胞等，任何這些方法的組合可能具有累加或協同作用。

4 小結與展望

最新研究表明，巨噬細胞在惡性血液腫瘤的發展中發揮著重要作用，因此，闡明巨噬細胞在骨髓微環境中功能變化的分子機制，將可能為未來腫瘤生物治療提供新的線索。而利用這些相互作用的治療方法可能是改善疾病預后并最終治愈骨髓瘤患者的關鍵。

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