電噴霧質譜脫溶劑過程的改進和應用

楊美成　張文　趙蕓　楊鵬翔

摘 要 電噴霧電離（ESI）技術由于脫溶劑過程中產生的電解作用及溶劑蒸發作用，使得酸性溶液噴霧液滴中質子殘留，pH值降低，導致蛋白質在液滴中的空間構象受到破壞，所得質譜圖無法正確反映蛋白質在溶劑中的真實構象。本研究以兩種經典蛋白質（細胞色素C和肌紅蛋白）為實驗樣本，通過在ESI源和質譜儀進樣端中間加入自行設計的空氣放大器，產生高流速大流量氣流，改善ESI脫溶劑過程。 結果表明，電噴霧電離的初始液滴在高流速大流量氣流引發的激烈碰撞中，被切割為粒徑極小的噴霧液滴，同時液滴所帶電荷被均分，從而使液滴pH值保持穩定，避免因ESI脫溶劑作用而破壞蛋白質的空間構象。基于高流速大流量氣流在ESI脫溶劑過程的新機理，在使用商業化的ESI源時，著重于鞘氣等脫溶劑輔助氣體的使用和調節。通過增大鞘氣的氣流量保持蛋白質的生物構象。

關鍵詞 電噴霧電離； 脫溶劑作用； 蛋白質空間構象； 噴霧液滴

1 引 言

電噴霧電離（Electronspray ionization， ESI）質譜已被廣泛應用于溶液中蛋白質的空間構象研究， 包括肌紅蛋白（Myoglobin）[1]、細胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等為人們所熟知的蛋白。雖然蛋白質電荷分布在ESI質譜圖上極具特色，但相應信息并不能直接反映蛋白質在溶液中的構象。眾所周知，pH值和溫度對蛋白質大分子的構象具有重大影響。由于ESI產生的電解作用[4]和脫溶劑作用[5]，在ESI正離子模式下噴出液滴的pH值比溶液實際pH值低得多[6]。在適用于大分子（包括蛋白質）的ESI帶電殘渣模型中[5]，液滴的pH值會不斷降低， 直至達到雷利極限，從而影響液滴中蛋白質的構象。此外，質譜儀的真空度[7]、霧簾氣（Curtain gas） [8，9]、毛細管溫度[10]以及錐電壓[11]等因素都對蛋白質的構象具有一定的影響。ESI正離子模式下， 電荷價態的高低和電荷分布（Charge state distribution， CSD）的寬窄常被用于表征蛋白質在溶液中是緊密折疊還是去折疊的構象[11]。蛋白質的天然構象常有一個狹窄的低電荷價態的CSD。 在特定條件下（如酸性溶液，高溫和有機溶劑）， 蛋白質天然構象因被破壞而導致變性，ESI質譜圖中會呈現更寬且更高電荷價態的CSD[2，12]。目前，針對在ESI過程中如何保持蛋白質構象的研究已有大量新方法報道，包括開發穩定試劑[13]和改進ESI源[14～16]等。

本研究對ESI脫溶劑過程進行了改進，在ESI源和質譜儀進樣端中間加入自行設計的空氣放大器（AA），利用空氣放大器產生的高流速大流量氣流，引發噴霧液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分為若干小液滴的同時，均分液滴中殘留質子，從而使蛋白質構象得以保持。探討了脫溶劑方法改進后的相應機理以及如何利用商品ESI源的輔助氣體盡量保持蛋白質等大分子在電噴離子化過程中的生物性狀。

2 實驗部分

2.1 儀器設備

LTQ離子阱質譜儀：配備商品ESI源（HESIII）的LTQ離子阱質譜儀（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘氣，0～50 arb（氣體流量單位）；輔助氣： 5～25 arb；輔助氣的加熱溫度： 20～300 ℃。

ESIAALTQ離子阱質譜儀：在自制的ESI源和LTQ離子阱質譜儀之間加入空氣放大器（AA）以改進電噴霧脫溶劑過程。高流速大流量氣流由空氣放大器產生。如圖1所示，引入空氣放大器的少量壓縮空氣在環形孔處被加速到超音速，產生了一個低壓真空區。周圍大量空氣被吸進這個低壓真空區，即可在空氣放大器的環形孔處產生高流速大流量氣流。利用空氣放大器，氣流量4～6 L/min的壓縮空氣可以產生40～70 L/min氣流。為了讓LTQ進樣端插入空氣放大器，原加熱毛細管（內徑0.5 mm，長10 cm）換成不銹鋼毛細管（內徑 0.76 mm，長度33 cm）。在相同的粘性流條件下，新的毛細管提供了與原毛細管相同的氣通量[17]。自制ESI源中的石英毛細管噴嘴（內徑100 μm，外徑160 μm）直接與樣品注射器相連。通過直接在樣品注射器的針尖處施加高電壓并傳遞到ESI的毛細管噴嘴，從而實現電噴霧電離。除在研究氣體流速與蛋白質構象關系實驗時，空氣放大器的氮氣進氣壓力有所改變，其余實驗壓力均設定在40 psi，相當于4.0 L/min的進氣流量。出口處的氣體流速估計為40 L/min，比商業ESI使用的霧簾氣或鞘氣的氣流量大。優化ESI源、空氣放大器和加熱毛細管的相對位置，以獲得最大的離子化效率。所有實驗樣品流速均設為3 μL/min。

2.2 樣品試劑

細胞色素C和肌紅蛋白（Sigma公司），直接用于實驗；固體蛋白質樣品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 備用；實驗過程中加入HCl或NH4OH調節溶液的pH值。

3 結果與討論

3.1 溶液pH值、ESI脫溶劑過程及質譜圖CSD分布關系

細胞色素C是一種被廣泛研究的蛋白質[2，3，18]，文獻報道，運用傳統ESI源，當溶液pH值在2～3時，質譜圖上呈現典型的雙模雙峰電荷分布。圖2展示了ESI源改進前后細胞色素C在溶液pH值為1.5，2.4和4.6時的ESI質譜圖。當空氣放大器關閉時，與文獻[2，3]報道結果一致： pH值=1.5時，細胞色素C的質譜圖呈現較寬且高價態單模電荷分布，表明蛋白質是完全展開的構象；pH值=4.6時，質譜圖呈現低價態較窄的單模電荷分布，表明細胞色素C為緊密折疊的構象；pH=2.4時，呈現雙模雙峰電荷分布，表明細胞色素C此時處于從緊密折疊到完全展開的過渡狀態[2]。空氣放大器打開時，不同pH值溶液的細胞色素C質譜圖電荷價態向更低價態移動；同時，雙模雙峰電荷分布消失（pH=2.4），呈現出低電荷數的單模分布。實驗表明，在低pH值條件下，使用高流速大流量氣流可以保持細胞色素C緊密折疊的生物構象。

3.2 采用高流速大流量氣流的ESI脫溶劑過程可保持蛋白質構象的機理研究

由圖2Aa可見，高流速大流量氣流降低了細胞色素C單模電荷分布5個單位（最高電荷從+16降至+11），而圖2Cc的溶液中并未觀察到明顯的電荷降低。這種明顯的電荷降低不可能僅是由于氣體碰撞時電荷轉移作用[19]引起的，因為電荷轉移作用與樣品的pH值無關，且程度相似。

為了更好地描述高流速大流量氣流帶來的電荷分布變化，使用公式（1）計算平均電荷數 ：

摘 要 電噴霧電離（ESI）技術由于脫溶劑過程中產生的電解作用及溶劑蒸發作用，使得酸性溶液噴霧液滴中質子殘留，pH值降低，導致蛋白質在液滴中的空間構象受到破壞，所得質譜圖無法正確反映蛋白質在溶劑中的真實構象。本研究以兩種經典蛋白質（細胞色素C和肌紅蛋白）為實驗樣本，通過在ESI源和質譜儀進樣端中間加入自行設計的空氣放大器，產生高流速大流量氣流，改善ESI脫溶劑過程。 結果表明，電噴霧電離的初始液滴在高流速大流量氣流引發的激烈碰撞中，被切割為粒徑極小的噴霧液滴，同時液滴所帶電荷被均分，從而使液滴pH值保持穩定，避免因ESI脫溶劑作用而破壞蛋白質的空間構象。基于高流速大流量氣流在ESI脫溶劑過程的新機理，在使用商業化的ESI源時，著重于鞘氣等脫溶劑輔助氣體的使用和調節。通過增大鞘氣的氣流量保持蛋白質的生物構象。

關鍵詞 電噴霧電離； 脫溶劑作用； 蛋白質空間構象； 噴霧液滴

1 引 言

電噴霧電離（Electronspray ionization， ESI）質譜已被廣泛應用于溶液中蛋白質的空間構象研究， 包括肌紅蛋白（Myoglobin）[1]、細胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等為人們所熟知的蛋白。雖然蛋白質電荷分布在ESI質譜圖上極具特色，但相應信息并不能直接反映蛋白質在溶液中的構象。眾所周知，pH值和溫度對蛋白質大分子的構象具有重大影響。由于ESI產生的電解作用[4]和脫溶劑作用[5]，在ESI正離子模式下噴出液滴的pH值比溶液實際pH值低得多[6]。在適用于大分子（包括蛋白質）的ESI帶電殘渣模型中[5]，液滴的pH值會不斷降低， 直至達到雷利極限，從而影響液滴中蛋白質的構象。此外，質譜儀的真空度[7]、霧簾氣（Curtain gas） [8，9]、毛細管溫度[10]以及錐電壓[11]等因素都對蛋白質的構象具有一定的影響。ESI正離子模式下， 電荷價態的高低和電荷分布（Charge state distribution， CSD）的寬窄常被用于表征蛋白質在溶液中是緊密折疊還是去折疊的構象[11]。蛋白質的天然構象常有一個狹窄的低電荷價態的CSD。 在特定條件下（如酸性溶液，高溫和有機溶劑）， 蛋白質天然構象因被破壞而導致變性，ESI質譜圖中會呈現更寬且更高電荷價態的CSD[2，12]。目前，針對在ESI過程中如何保持蛋白質構象的研究已有大量新方法報道，包括開發穩定試劑[13]和改進ESI源[14～16]等。

本研究對ESI脫溶劑過程進行了改進，在ESI源和質譜儀進樣端中間加入自行設計的空氣放大器（AA），利用空氣放大器產生的高流速大流量氣流，引發噴霧液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分為若干小液滴的同時，均分液滴中殘留質子，從而使蛋白質構象得以保持。探討了脫溶劑方法改進后的相應機理以及如何利用商品ESI源的輔助氣體盡量保持蛋白質等大分子在電噴離子化過程中的生物性狀。

2 實驗部分

2.1 儀器設備

LTQ離子阱質譜儀：配備商品ESI源（HESIII）的LTQ離子阱質譜儀（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘氣，0～50 arb（氣體流量單位）；輔助氣： 5～25 arb；輔助氣的加熱溫度： 20～300 ℃。

ESIAALTQ離子阱質譜儀：在自制的ESI源和LTQ離子阱質譜儀之間加入空氣放大器（AA）以改進電噴霧脫溶劑過程。高流速大流量氣流由空氣放大器產生。如圖1所示，引入空氣放大器的少量壓縮空氣在環形孔處被加速到超音速，產生了一個低壓真空區。周圍大量空氣被吸進這個低壓真空區，即可在空氣放大器的環形孔處產生高流速大流量氣流。利用空氣放大器，氣流量4～6 L/min的壓縮空氣可以產生40～70 L/min氣流。為了讓LTQ進樣端插入空氣放大器，原加熱毛細管（內徑0.5 mm，長10 cm）換成不銹鋼毛細管（內徑 0.76 mm，長度33 cm）。在相同的粘性流條件下，新的毛細管提供了與原毛細管相同的氣通量[17]。自制ESI源中的石英毛細管噴嘴（內徑100 μm，外徑160 μm）直接與樣品注射器相連。通過直接在樣品注射器的針尖處施加高電壓并傳遞到ESI的毛細管噴嘴，從而實現電噴霧電離。除在研究氣體流速與蛋白質構象關系實驗時，空氣放大器的氮氣進氣壓力有所改變，其余實驗壓力均設定在40 psi，相當于4.0 L/min的進氣流量。出口處的氣體流速估計為40 L/min，比商業ESI使用的霧簾氣或鞘氣的氣流量大。優化ESI源、空氣放大器和加熱毛細管的相對位置，以獲得最大的離子化效率。所有實驗樣品流速均設為3 μL/min。

2.2 樣品試劑

細胞色素C和肌紅蛋白（Sigma公司），直接用于實驗；固體蛋白質樣品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 備用；實驗過程中加入HCl或NH4OH調節溶液的pH值。

3 結果與討論

3.1 溶液pH值、ESI脫溶劑過程及質譜圖CSD分布關系

細胞色素C是一種被廣泛研究的蛋白質[2，3，18]，文獻報道，運用傳統ESI源，當溶液pH值在2～3時，質譜圖上呈現典型的雙模雙峰電荷分布。圖2展示了ESI源改進前后細胞色素C在溶液pH值為1.5，2.4和4.6時的ESI質譜圖。當空氣放大器關閉時，與文獻[2，3]報道結果一致： pH值=1.5時，細胞色素C的質譜圖呈現較寬且高價態單模電荷分布，表明蛋白質是完全展開的構象；pH值=4.6時，質譜圖呈現低價態較窄的單模電荷分布，表明細胞色素C為緊密折疊的構象；pH=2.4時，呈現雙模雙峰電荷分布，表明細胞色素C此時處于從緊密折疊到完全展開的過渡狀態[2]。空氣放大器打開時，不同pH值溶液的細胞色素C質譜圖電荷價態向更低價態移動；同時，雙模雙峰電荷分布消失（pH=2.4），呈現出低電荷數的單模分布。實驗表明，在低pH值條件下，使用高流速大流量氣流可以保持細胞色素C緊密折疊的生物構象。

3.2 采用高流速大流量氣流的ESI脫溶劑過程可保持蛋白質構象的機理研究

由圖2Aa可見，高流速大流量氣流降低了細胞色素C單模電荷分布5個單位（最高電荷從+16降至+11），而圖2Cc的溶液中并未觀察到明顯的電荷降低。這種明顯的電荷降低不可能僅是由于氣體碰撞時電荷轉移作用[19]引起的，因為電荷轉移作用與樣品的pH值無關，且程度相似。

為了更好地描述高流速大流量氣流帶來的電荷分布變化，使用公式（1）計算平均電荷數 ：

摘 要 電噴霧電離（ESI）技術由于脫溶劑過程中產生的電解作用及溶劑蒸發作用，使得酸性溶液噴霧液滴中質子殘留，pH值降低，導致蛋白質在液滴中的空間構象受到破壞，所得質譜圖無法正確反映蛋白質在溶劑中的真實構象。本研究以兩種經典蛋白質（細胞色素C和肌紅蛋白）為實驗樣本，通過在ESI源和質譜儀進樣端中間加入自行設計的空氣放大器，產生高流速大流量氣流，改善ESI脫溶劑過程。 結果表明，電噴霧電離的初始液滴在高流速大流量氣流引發的激烈碰撞中，被切割為粒徑極小的噴霧液滴，同時液滴所帶電荷被均分，從而使液滴pH值保持穩定，避免因ESI脫溶劑作用而破壞蛋白質的空間構象。基于高流速大流量氣流在ESI脫溶劑過程的新機理，在使用商業化的ESI源時，著重于鞘氣等脫溶劑輔助氣體的使用和調節。通過增大鞘氣的氣流量保持蛋白質的生物構象。

關鍵詞 電噴霧電離； 脫溶劑作用； 蛋白質空間構象； 噴霧液滴

1 引 言

電噴霧電離（Electronspray ionization， ESI）質譜已被廣泛應用于溶液中蛋白質的空間構象研究， 包括肌紅蛋白（Myoglobin）[1]、細胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等為人們所熟知的蛋白。雖然蛋白質電荷分布在ESI質譜圖上極具特色，但相應信息并不能直接反映蛋白質在溶液中的構象。眾所周知，pH值和溫度對蛋白質大分子的構象具有重大影響。由于ESI產生的電解作用[4]和脫溶劑作用[5]，在ESI正離子模式下噴出液滴的pH值比溶液實際pH值低得多[6]。在適用于大分子（包括蛋白質）的ESI帶電殘渣模型中[5]，液滴的pH值會不斷降低， 直至達到雷利極限，從而影響液滴中蛋白質的構象。此外，質譜儀的真空度[7]、霧簾氣（Curtain gas） [8，9]、毛細管溫度[10]以及錐電壓[11]等因素都對蛋白質的構象具有一定的影響。ESI正離子模式下， 電荷價態的高低和電荷分布（Charge state distribution， CSD）的寬窄常被用于表征蛋白質在溶液中是緊密折疊還是去折疊的構象[11]。蛋白質的天然構象常有一個狹窄的低電荷價態的CSD。 在特定條件下（如酸性溶液，高溫和有機溶劑）， 蛋白質天然構象因被破壞而導致變性，ESI質譜圖中會呈現更寬且更高電荷價態的CSD[2，12]。目前，針對在ESI過程中如何保持蛋白質構象的研究已有大量新方法報道，包括開發穩定試劑[13]和改進ESI源[14～16]等。

本研究對ESI脫溶劑過程進行了改進，在ESI源和質譜儀進樣端中間加入自行設計的空氣放大器（AA），利用空氣放大器產生的高流速大流量氣流，引發噴霧液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分為若干小液滴的同時，均分液滴中殘留質子，從而使蛋白質構象得以保持。探討了脫溶劑方法改進后的相應機理以及如何利用商品ESI源的輔助氣體盡量保持蛋白質等大分子在電噴離子化過程中的生物性狀。

2 實驗部分

2.1 儀器設備

LTQ離子阱質譜儀：配備商品ESI源（HESIII）的LTQ離子阱質譜儀（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘氣，0～50 arb（氣體流量單位）；輔助氣： 5～25 arb；輔助氣的加熱溫度： 20～300 ℃。

ESIAALTQ離子阱質譜儀：在自制的ESI源和LTQ離子阱質譜儀之間加入空氣放大器（AA）以改進電噴霧脫溶劑過程。高流速大流量氣流由空氣放大器產生。如圖1所示，引入空氣放大器的少量壓縮空氣在環形孔處被加速到超音速，產生了一個低壓真空區。周圍大量空氣被吸進這個低壓真空區，即可在空氣放大器的環形孔處產生高流速大流量氣流。利用空氣放大器，氣流量4～6 L/min的壓縮空氣可以產生40～70 L/min氣流。為了讓LTQ進樣端插入空氣放大器，原加熱毛細管（內徑0.5 mm，長10 cm）換成不銹鋼毛細管（內徑 0.76 mm，長度33 cm）。在相同的粘性流條件下，新的毛細管提供了與原毛細管相同的氣通量[17]。自制ESI源中的石英毛細管噴嘴（內徑100 μm，外徑160 μm）直接與樣品注射器相連。通過直接在樣品注射器的針尖處施加高電壓并傳遞到ESI的毛細管噴嘴，從而實現電噴霧電離。除在研究氣體流速與蛋白質構象關系實驗時，空氣放大器的氮氣進氣壓力有所改變，其余實驗壓力均設定在40 psi，相當于4.0 L/min的進氣流量。出口處的氣體流速估計為40 L/min，比商業ESI使用的霧簾氣或鞘氣的氣流量大。優化ESI源、空氣放大器和加熱毛細管的相對位置，以獲得最大的離子化效率。所有實驗樣品流速均設為3 μL/min。

2.2 樣品試劑

細胞色素C和肌紅蛋白（Sigma公司），直接用于實驗；固體蛋白質樣品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 備用；實驗過程中加入HCl或NH4OH調節溶液的pH值。

3 結果與討論

3.1 溶液pH值、ESI脫溶劑過程及質譜圖CSD分布關系

細胞色素C是一種被廣泛研究的蛋白質[2，3，18]，文獻報道，運用傳統ESI源，當溶液pH值在2～3時，質譜圖上呈現典型的雙模雙峰電荷分布。圖2展示了ESI源改進前后細胞色素C在溶液pH值為1.5，2.4和4.6時的ESI質譜圖。當空氣放大器關閉時，與文獻[2，3]報道結果一致： pH值=1.5時，細胞色素C的質譜圖呈現較寬且高價態單模電荷分布，表明蛋白質是完全展開的構象；pH值=4.6時，質譜圖呈現低價態較窄的單模電荷分布，表明細胞色素C為緊密折疊的構象；pH=2.4時，呈現雙模雙峰電荷分布，表明細胞色素C此時處于從緊密折疊到完全展開的過渡狀態[2]。空氣放大器打開時，不同pH值溶液的細胞色素C質譜圖電荷價態向更低價態移動；同時，雙模雙峰電荷分布消失（pH=2.4），呈現出低電荷數的單模分布。實驗表明，在低pH值條件下，使用高流速大流量氣流可以保持細胞色素C緊密折疊的生物構象。

3.2 采用高流速大流量氣流的ESI脫溶劑過程可保持蛋白質構象的機理研究

由圖2Aa可見，高流速大流量氣流降低了細胞色素C單模電荷分布5個單位（最高電荷從+16降至+11），而圖2Cc的溶液中并未觀察到明顯的電荷降低。這種明顯的電荷降低不可能僅是由于氣體碰撞時電荷轉移作用[19]引起的，因為電荷轉移作用與樣品的pH值無關，且程度相似。

為了更好地描述高流速大流量氣流帶來的電荷分布變化，使用公式（1）計算平均電荷數 ：