分子印跡固相萃取液相色譜質譜法測定果蔬中20種三唑類農藥殘留

胡艷云　徐慧群等

摘 要 以三唑酮為模板分子，三氟甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，合成了對三唑類農藥具有高選擇性的分子印跡聚合物。將印跡聚合物作為固相萃取填料，優化分離、富集三唑類農藥的最優上樣、淋洗和洗脫條件。結合液相色譜串聯質譜法，實現了果蔬樣品中20種三唑類殺菌劑的高通量特異性檢測。對樣品前處理過程中的加標回收率進行了考察，并對比了分子印跡固相萃取和ENVICarb/SPE小柱的基質效應。結果表明：在1.0， 2.0 和10.0 μg/kg加標水平下，三唑類農藥的回收率在 81.0%～109.7% 之間，相對標準偏差小于12.6%，基質效應在 91.1%～121.8%之間。方法靈敏、準確度高，與ENVICarb/SPE 小柱相比，能更有效減弱基體效應。

關鍵詞 分子印跡聚合物； 固相萃取； 三唑類農藥

1 引 言

三唑類殺菌劑是指含有1，2，4三唑環的化合物，由于具有低毒、內吸性強、持效期長等優點，被廣泛應用于水果、蔬菜、稻谷等病蟲害的防治 [1～3 ]。隨著三唑類農藥的廣泛應用，其在農產品和環境中的殘留問題，也逐漸引起人們的重視。對其在食品和環境中的殘留分析需要從復雜的基質樣品中將低濃度的目標化合物高效提取和凈化，因此對樣品前處理提出較高要求。而傳統上廣泛使用的固相萃取技術特異性不強，常發生雜質共萃取現象 [4，5 ]。因此亟待開發一種快速、靈敏、特異的檢測技術。

分子印跡聚合物（MIPs）能夠選擇性提取復雜樣品中的目標分子或與目標分子結構相似的化合物， 適合作為固相萃取的材料 [6～8 ]。與傳統的固相萃取柱相比，分子印跡固相萃取（MISPE）克服了試樣體系復雜、預處理繁瑣等不利因素，提高了分析準確性，更適用于痕量分析 [9～12 ]。三唑類化合物的MISPE方法已有少量文獻報道，彭暢等 [13 ]采用鄰硝基苯酚為替代模板，4乙烯基吡啶為功能單體，合成了對7種三唑類化合物具有特異性吸附的印跡聚合物，并應用于土壤樣品的分析中。

本研究以三唑酮為模板分子，三氟甲基丙烯酸為功能單體，合成了對20種三唑類農藥具有高選擇性的MIP材料。MISPE結合液相色譜串聯質譜法，實現了果蔬樣品中三唑類殺菌劑殘留的特異性分離富集和檢測，方法快速、靈敏、準確度高，與現有SPE技術相比，有效降低了樣品基質效應。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

Agilent 1200液相色譜儀（美國Agilent公司），API 4000液相色譜串聯質譜儀（美國Applied Biosystems公司）；E811全自動索氏提取儀（瑞士Buchi公司）。

三唑酮等農藥標準品（Dr. Ehrenstorfer公司）；三氟甲基丙烯酸（Trifluoromethyl acrylic acid， TFMAA），乙二醇二甲基丙烯酸酯（Ethyleneglycol dimethacrylate， Egdma），均為分析純（SigmaAldrich公司），使用前純化；偶氮二異丁腈 （Azobisisbutyronitrile， AIBN，化學純，上海試劑四廠）；乙酸（分析純，國藥集團）；乙腈、乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、甲苯（色譜純， 美國Tedia公司）。石墨化碳黑SPE柱（ENVICarb/PSA PE，0.5 g， 6 mL，美國SigmaAldrich公司）。

2.2 標準溶液的配制

分別稱取三唑酮等農藥標準品（純度>99.5%）各10～20 mg， 溶于乙腈并定容至 100 mL，配制成100～200 mg/L標準儲備液。混合標準中間液以單標儲備液稀釋配制而成，濃度為1.0 mg/L， 混合標準工作液（0.2， 0.1， 0.05， 0.02， 0.01， 0.005和0.001 mg/L）由混合標準中間液用乙腈逐級稀釋而成。

2.3 實驗方法

色譜柱為Waters C18柱（100 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：200 μL/min；進樣量：10 μL；流動相：乙腈（A），10 mmol/L乙酸銨溶液（B）；梯度：0～5 min，10%～30% A；5～15 min，30%～50% A；15～25 min，50%～95% A；25～25.1 min，95%～10% A；25.1～35 min，10% A。

電噴霧電壓：5500 V；霧化氣壓力： 4.14 MPa；氣簾氣壓力：1.38 MPa；輔助氣流速：4.14×103； 離子源溫度：450 ℃；正離子多反應監測；碰撞氣：Medium；，定性離子對和定量離子對的去簇電壓（Declustering potential，DP）、碰撞能量（Collision energy，CE）見表1。

2.4 印跡聚合物制備

將1 mmol三唑酮溶于60 mL三氯甲烷甲苯（2 ∶ 1， V/V）中， 加入4 mmol TFMAA，超聲1 h，使三唑酮與TFMAA充分作用；加入20 mmol EGDMA和60 mg AIBN，超聲0.5 h，充分混溶后，通N2脫氧30 min，真空狀態下密封；將其放入60 ℃的恒溫水浴中反應24 h，取出，干燥，研磨過篩， 以甲醇乙酸（9 ∶ 1， V/V）為提取劑，索氏提取24 h； 用甲醇洗至中性，在25 ℃下真空干燥過夜，得到印跡聚合物MIPs。非印跡聚合物（Nonimprinted polymers，NIPs）的合成除不加分子模板三唑酮外，其余步驟同上。

2.5 三唑酮分子印跡的平衡吸附實驗

取MIPs以及NIPs各50 mg放入具塞試管中，分別加入10 mL不同濃度（0～2.6 mmol/L）的三唑酮溶液，渦旋10 min。計算其吸附量Q，由Q作結合等溫線圖，并進行Scatchard分析。

聚合物吸附率的計算公式：Q=（C0-Ct）V/m， 單位（μmol/g）， 其中C0為三唑酮的原始濃度， Ct為三唑酮吸附過程中的平衡濃度， V為三唑酮溶液的體積， m為聚合物的質量。

2.6 樣品的預處理

稱取5.0 g（準確至0.01 g）粉碎后的樣品于50 mL離心管內，加20 mL丙酮乙酸乙酯正己烷（12 ∶ 1， V/V）渦旋混勻提取2 min ，以3000 r/min離心5 min，將上清液轉移至濃縮瓶中。在離心管中再加入20 mL提取液，重復上述操作，合并提取液，在40 ℃以下，濃縮至近干，用2 mL乙腈清洗，用水定容至10 mL，待凈化。

2.7 固相萃取實驗

2.7.1 MISPE柱的制備及萃取條件優化 稱取50 mg MIPs加入到空SPE柱中，加入篩板，壓緊制成MISPE柱。將三唑類混標溶解在不同的溶劑中配成0.10 mg/L的溶液，取10 mL溶液過柱，采用不同溶劑進行淋洗和洗脫，收集洗脫液，吹干后溶解于10 mL乙腈中，用LCMS/MS測定。考察不同的上樣、淋洗、洗脫條件下MISPE柱對20種三唑類農藥的保留能力。

2.7.2 MISPE柱、ENVICarb/PSA柱對實際樣品中三唑類物質的分離、富集 MISPE：依次用2 mL乙腈、2 mL 20%乙腈（V/V）淋洗活化MISPE柱，將2.6節預處理制得的10 mL三唑類溶液，以不超過1.0 mL/min的流速過柱， 用2 mL 20%乙腈洗滌，最后用5 mL乙腈洗脫。

ENVICarb/PSA SPE：柱中加入約2 cm高的無水硫酸鈉，用2 mL乙腈甲苯（3 ∶ 1，V/V）活化柱體。樣品參照2.6節凈化處理后，用6 mL 乙腈甲苯（3 ∶ 1， V/V）分3次洗滌濃縮瓶。將上述提取液傾入柱中，收集流出液。

2.8 基質效應

空白樣品按照上述前處理方法處理后，在空白基質中添加1.0 mL的1.0 和10.0 mg/L的三唑類標準品，通過比較含樣品基質的標準化合物的峰面積與溶解在純溶劑中化合物的峰面積之比計算基質效應。

3 結果與討論

3.1 致孔劑對聚合物的影響

致孔劑不僅影響著聚合物的形態和結構，且在聚合時控制非共價鍵結合的程度，在分子印跡制備中發揮著重要作用 [14，15 ]。在非共價印跡體系中，致孔劑要對試劑有較高的溶解性，且不干擾模板和單體之間的相互作用。為了研究致孔劑對聚合物的影響，選用乙腈、氯仿、氯仿甲苯分別為致孔劑合成了分子印跡聚合物，用掃描電鏡進行表征。從圖1可見，以乙腈為致孔劑得到的是大孔型聚合物且孔結構不均勻；以氯仿為致孔劑的聚合物孔結構致密，模板分子不易被洗脫，會造成模板泄露問題，且聚合物堅硬、密實，研磨費力。在氯仿中加少量甲苯發現，聚合物的硬度明顯變軟，呈現高度交聯的微孔結構，這些孔結構增加了聚合物的表面積，同時聚合物的多孔結構有效避免了后續處理中模板分子難以洗脫分離的問題，從而為模板分子的吸附和洗脫提供了條件。

[TS（][HT5”SS] 圖1 不同致孔劑制備的分子印跡聚合物的掃描電鏡圖

Fig.1 Scanning electron microscope photographs of molecularly imprinted polymer （MIPs） prepared by different porogens

A. 乙腈 （Acetonitrile）； B. 三氯甲烷（Chloroform）； C. 三氯甲烷與甲苯的混合溶劑（Chloroformtoluene mixtures）。 [HT5][TS）]

3.2 吸附性能研究

通過靜態吸附實驗研究了三唑酮MIPs和NIPs上的吸附性，吸附等溫線如圖2。隨著三唑酮濃度的增加，MIPs對三唑酮的吸附容量增加且MIPs的吸附量明顯高于NIPs的吸附量，這是由于三唑酮與三氟甲基丙烯酸之間通過氫鍵形成了特異性的結合位點。NIPs的內部由于不具有特異性的結合位點，主要依靠聚合物表面的非特異性吸附作用，無法對模板分子進行有效地識別。對吸附時間動力學也做了研究，結果發現，渦旋10 min后，三唑酮在MIPs的吸附達到飽和。

聚合物吸附率的計算公式：Q=（C0-Ct）V/m， 單位（μmol/g）， 其中C0為三唑酮的原始濃度， Ct為三唑酮吸附過程中的平衡濃度， V為三唑酮溶液的體積， m為聚合物的質量。

2.6 樣品的預處理

稱取5.0 g（準確至0.01 g）粉碎后的樣品于50 mL離心管內，加20 mL丙酮乙酸乙酯正己烷（12 ∶ 1， V/V）渦旋混勻提取2 min ，以3000 r/min離心5 min，將上清液轉移至濃縮瓶中。在離心管中再加入20 mL提取液，重復上述操作，合并提取液，在40 ℃以下，濃縮至近干，用2 mL乙腈清洗，用水定容至10 mL，待凈化。

2.7 固相萃取實驗

2.7.1 MISPE柱的制備及萃取條件優化 稱取50 mg MIPs加入到空SPE柱中，加入篩板，壓緊制成MISPE柱。將三唑類混標溶解在不同的溶劑中配成0.10 mg/L的溶液，取10 mL溶液過柱，采用不同溶劑進行淋洗和洗脫，收集洗脫液，吹干后溶解于10 mL乙腈中，用LCMS/MS測定。考察不同的上樣、淋洗、洗脫條件下MISPE柱對20種三唑類農藥的保留能力。

2.7.2 MISPE柱、ENVICarb/PSA柱對實際樣品中三唑類物質的分離、富集 MISPE：依次用2 mL乙腈、2 mL 20%乙腈（V/V）淋洗活化MISPE柱，將2.6節預處理制得的10 mL三唑類溶液，以不超過1.0 mL/min的流速過柱， 用2 mL 20%乙腈洗滌，最后用5 mL乙腈洗脫。

ENVICarb/PSA SPE：柱中加入約2 cm高的無水硫酸鈉，用2 mL乙腈甲苯（3 ∶ 1，V/V）活化柱體。樣品參照2.6節凈化處理后，用6 mL 乙腈甲苯（3 ∶ 1， V/V）分3次洗滌濃縮瓶。將上述提取液傾入柱中，收集流出液。

2.8 基質效應

空白樣品按照上述前處理方法處理后，在空白基質中添加1.0 mL的1.0 和10.0 mg/L的三唑類標準品，通過比較含樣品基質的標準化合物的峰面積與溶解在純溶劑中化合物的峰面積之比計算基質效應。

3 結果與討論

3.1 致孔劑對聚合物的影響

致孔劑不僅影響著聚合物的形態和結構，且在聚合時控制非共價鍵結合的程度，在分子印跡制備中發揮著重要作用 [14，15 ]。在非共價印跡體系中，致孔劑要對試劑有較高的溶解性，且不干擾模板和單體之間的相互作用。為了研究致孔劑對聚合物的影響，選用乙腈、氯仿、氯仿甲苯分別為致孔劑合成了分子印跡聚合物，用掃描電鏡進行表征。從圖1可見，以乙腈為致孔劑得到的是大孔型聚合物且孔結構不均勻；以氯仿為致孔劑的聚合物孔結構致密，模板分子不易被洗脫，會造成模板泄露問題，且聚合物堅硬、密實，研磨費力。在氯仿中加少量甲苯發現，聚合物的硬度明顯變軟，呈現高度交聯的微孔結構，這些孔結構增加了聚合物的表面積，同時聚合物的多孔結構有效避免了后續處理中模板分子難以洗脫分離的問題，從而為模板分子的吸附和洗脫提供了條件。

[TS（][HT5”SS] 圖1 不同致孔劑制備的分子印跡聚合物的掃描電鏡圖

Fig.1 Scanning electron microscope photographs of molecularly imprinted polymer （MIPs） prepared by different porogens

A. 乙腈 （Acetonitrile）； B. 三氯甲烷（Chloroform）； C. 三氯甲烷與甲苯的混合溶劑（Chloroformtoluene mixtures）。 [HT5][TS）]

3.2 吸附性能研究

通過靜態吸附實驗研究了三唑酮MIPs和NIPs上的吸附性，吸附等溫線如圖2。隨著三唑酮濃度的增加，MIPs對三唑酮的吸附容量增加且MIPs的吸附量明顯高于NIPs的吸附量，這是由于三唑酮與三氟甲基丙烯酸之間通過氫鍵形成了特異性的結合位點。NIPs的內部由于不具有特異性的結合位點，主要依靠聚合物表面的非特異性吸附作用，無法對模板分子進行有效地識別。對吸附時間動力學也做了研究，結果發現，渦旋10 min后，三唑酮在MIPs的吸附達到飽和。

聚合物吸附率的計算公式：Q=（C0-Ct）V/m， 單位（μmol/g）， 其中C0為三唑酮的原始濃度， Ct為三唑酮吸附過程中的平衡濃度， V為三唑酮溶液的體積， m為聚合物的質量。

2.6 樣品的預處理

稱取5.0 g（準確至0.01 g）粉碎后的樣品于50 mL離心管內，加20 mL丙酮乙酸乙酯正己烷（12 ∶ 1， V/V）渦旋混勻提取2 min ，以3000 r/min離心5 min，將上清液轉移至濃縮瓶中。在離心管中再加入20 mL提取液，重復上述操作，合并提取液，在40 ℃以下，濃縮至近干，用2 mL乙腈清洗，用水定容至10 mL，待凈化。

2.7 固相萃取實驗

2.7.1 MISPE柱的制備及萃取條件優化 稱取50 mg MIPs加入到空SPE柱中，加入篩板，壓緊制成MISPE柱。將三唑類混標溶解在不同的溶劑中配成0.10 mg/L的溶液，取10 mL溶液過柱，采用不同溶劑進行淋洗和洗脫，收集洗脫液，吹干后溶解于10 mL乙腈中，用LCMS/MS測定。考察不同的上樣、淋洗、洗脫條件下MISPE柱對20種三唑類農藥的保留能力。

2.7.2 MISPE柱、ENVICarb/PSA柱對實際樣品中三唑類物質的分離、富集 MISPE：依次用2 mL乙腈、2 mL 20%乙腈（V/V）淋洗活化MISPE柱，將2.6節預處理制得的10 mL三唑類溶液，以不超過1.0 mL/min的流速過柱， 用2 mL 20%乙腈洗滌，最后用5 mL乙腈洗脫。

ENVICarb/PSA SPE：柱中加入約2 cm高的無水硫酸鈉，用2 mL乙腈甲苯（3 ∶ 1，V/V）活化柱體。樣品參照2.6節凈化處理后，用6 mL 乙腈甲苯（3 ∶ 1， V/V）分3次洗滌濃縮瓶。將上述提取液傾入柱中，收集流出液。

2.8 基質效應

空白樣品按照上述前處理方法處理后，在空白基質中添加1.0 mL的1.0 和10.0 mg/L的三唑類標準品，通過比較含樣品基質的標準化合物的峰面積與溶解在純溶劑中化合物的峰面積之比計算基質效應。

3 結果與討論

3.1 致孔劑對聚合物的影響

致孔劑不僅影響著聚合物的形態和結構，且在聚合時控制非共價鍵結合的程度，在分子印跡制備中發揮著重要作用 [14，15 ]。在非共價印跡體系中，致孔劑要對試劑有較高的溶解性，且不干擾模板和單體之間的相互作用。為了研究致孔劑對聚合物的影響，選用乙腈、氯仿、氯仿甲苯分別為致孔劑合成了分子印跡聚合物，用掃描電鏡進行表征。從圖1可見，以乙腈為致孔劑得到的是大孔型聚合物且孔結構不均勻；以氯仿為致孔劑的聚合物孔結構致密，模板分子不易被洗脫，會造成模板泄露問題，且聚合物堅硬、密實，研磨費力。在氯仿中加少量甲苯發現，聚合物的硬度明顯變軟，呈現高度交聯的微孔結構，這些孔結構增加了聚合物的表面積，同時聚合物的多孔結構有效避免了后續處理中模板分子難以洗脫分離的問題，從而為模板分子的吸附和洗脫提供了條件。

[TS（][HT5”SS] 圖1 不同致孔劑制備的分子印跡聚合物的掃描電鏡圖

Fig.1 Scanning electron microscope photographs of molecularly imprinted polymer （MIPs） prepared by different porogens

A. 乙腈 （Acetonitrile）； B. 三氯甲烷（Chloroform）； C. 三氯甲烷與甲苯的混合溶劑（Chloroformtoluene mixtures）。 [HT5][TS）]

3.2 吸附性能研究

通過靜態吸附實驗研究了三唑酮MIPs和NIPs上的吸附性，吸附等溫線如圖2。隨著三唑酮濃度的增加，MIPs對三唑酮的吸附容量增加且MIPs的吸附量明顯高于NIPs的吸附量，這是由于三唑酮與三氟甲基丙烯酸之間通過氫鍵形成了特異性的結合位點。NIPs的內部由于不具有特異性的結合位點，主要依靠聚合物表面的非特異性吸附作用，無法對模板分子進行有效地識別。對吸附時間動力學也做了研究，結果發現，渦旋10 min后，三唑酮在MIPs的吸附達到飽和。