肽段固相等電聚焦結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析鼠肝蛋白質(zhì)

劉鴻　姚鋆　楊芃原　樊惠芝

摘要 利用肽段固相膠條等電聚焦技術(shù)對大鼠鼠肝組織蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進行預分離，反相色譜分離所得預分離組分后，用LTQOrbitrap MS進行分析。共鑒定到2039個蛋白質(zhì)，包括18個乙酰化蛋白，其中4個乙酰化蛋白未被報道過。對這些蛋白進行了生物信息學分析。結(jié)果表明，將肽段等電聚焦與LCMS/MS結(jié)合起來，是一種有效的蛋白質(zhì)組學分析技術(shù)，適合于大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定分析。

關(guān)鍵詞 固相等電聚焦； 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用； 鼠肝蛋白質(zhì)

1引言

蛋白質(zhì)的分離與鑒定是蛋白質(zhì)組學研究的重要內(nèi)容，但由于生物樣品的復雜性，在進行蛋白鑒定分析前，往往需要預分離簡化體系后再進行鑒定分析。蛋白質(zhì)等電聚焦分離技術(shù)是一種有效的預分離方法，被用于蛋白質(zhì)組學研究中，取得了很好的成果[1～5]。但蛋白質(zhì)的液相等電聚焦在研究中存在一些問題，例如聚焦結(jié)束后需對分離的各組分蛋白質(zhì)分別酶解，溶液中pH值不穩(wěn)定，同時在線分析能力不強，所以科學家又發(fā)展了肽段固相等電聚焦的方法。

基于固相pH梯度（Immobilized pH gradients，IPG） 膠條的肽段等電聚焦分離技術(shù)（Peptide IPG IEF）是液相等電聚焦的重大發(fā)展。它利用傳統(tǒng)的2 DE分離儀器，在IPG 膠條上對肽段進行等電聚焦分離。2008年，Hubner等[6]采用Peptide IPG IEF代替膠內(nèi)酶解技術(shù)，將其引入蛋白質(zhì)組學分析中。同年，Chick等[7]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了鼠肝中的膜蛋白，他們通過此方法共發(fā)現(xiàn)了1549個非冗余膜蛋白。 2009年，McQuade等[8]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了人類胚胎干細胞，這種技術(shù)提高了蛋白檢測的覆蓋率，是一種有效的蛋白質(zhì)組學分析流程。 Peptide IPGIEF簡便易行，上樣量大（mg級），同時膠條上pH值穩(wěn)定，并且對肽段的提取和后續(xù)處理非常簡便，非常適合與LCMS/MS聯(lián)用，是一種非常有效的蛋白質(zhì)組學分離分析工具[7，9，10]。

本研究將Peptide IPG IEF分離分析技術(shù)運用于復雜生物樣品——鼠肝組織蛋白表達譜研究。利用Peptide IPGIEF良好的預分離能力和LTQ Orbitrap質(zhì)譜的高分辨能力，對大鼠肝臟組織全蛋白進行鑒定分析，同時也對其乙酰化修飾進行了鑒定。在大鼠鼠肝中共鑒定到2039個蛋白，其中鑒定到18個賴氨酸乙酰化修飾蛋白及18個賴氨基酸乙酰化修飾位點。在鑒定到的乙酰化蛋白中，包括4個新的乙酰化蛋白和8個新的乙酰化位點，這些結(jié)果也為乙酰化蛋白研究提供了重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和方法參考。 同時，本研究對樣品分離富集，降低樣品的復雜度，提高蛋白的上樣量，為無合適抗體的蛋白質(zhì)分析奠定基礎(chǔ)。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

等電聚焦儀；Protean II垂直電泳儀（BioRad公司）；真空冷凍干燥機（德國Christ公司）；MilliQ超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；系統(tǒng)： Nano Aquity液相色譜（Waters公司），納升級LC20AD（島津公司）。LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀（Thermo Fisher公司）。Peptide captrap C18色譜捕集柱 （2 mm×0.5 mm， Michrom公司）；Magic C18 AQ分析柱 （100 μm×150 mm，5 μm ，Michrom公司）。

pH 310 NL 18 cm IPG膠條， Ampholyte （GE Healthcare）； Trypsin （Proteomics Sequencing Grade Modified， Sigma公司）；蛋白酶抑制劑（Protease inhibitor cocktail，Roche公司）；TSA（Tocris Bioscience公司）；煙酰胺（US Biological公司）；其余試劑為進口或國產(chǎn)試劑分裝。色譜所用試劑均為HPLC級。

2.2實驗方法

實驗主要流程見圖1： 首先提取鼠肝全蛋白，用胰蛋白酶進行溶液酶解，得到的酶解肽段用18 cm 的pH 3～10 NL IPG 膠條進行Peptide IPG IEF分離，分離完全后將膠條分割為18份，并用0.1%甲酸溶液分別提取肽段，提取的肽段溶液用LCMS/MS分離鑒定，最后將得到的蛋白進行數(shù)據(jù)分析。

摘要 利用肽段固相膠條等電聚焦技術(shù)對大鼠鼠肝組織蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進行預分離，反相色譜分離所得預分離組分后，用LTQOrbitrap MS進行分析。共鑒定到2039個蛋白質(zhì)，包括18個乙酰化蛋白，其中4個乙酰化蛋白未被報道過。對這些蛋白進行了生物信息學分析。結(jié)果表明，將肽段等電聚焦與LCMS/MS結(jié)合起來，是一種有效的蛋白質(zhì)組學分析技術(shù)，適合于大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定分析。

關(guān)鍵詞 固相等電聚焦； 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用； 鼠肝蛋白質(zhì)

1引言

蛋白質(zhì)的分離與鑒定是蛋白質(zhì)組學研究的重要內(nèi)容，但由于生物樣品的復雜性，在進行蛋白鑒定分析前，往往需要預分離簡化體系后再進行鑒定分析。蛋白質(zhì)等電聚焦分離技術(shù)是一種有效的預分離方法，被用于蛋白質(zhì)組學研究中，取得了很好的成果[1～5]。但蛋白質(zhì)的液相等電聚焦在研究中存在一些問題，例如聚焦結(jié)束后需對分離的各組分蛋白質(zhì)分別酶解，溶液中pH值不穩(wěn)定，同時在線分析能力不強，所以科學家又發(fā)展了肽段固相等電聚焦的方法。

基于固相pH梯度（Immobilized pH gradients，IPG） 膠條的肽段等電聚焦分離技術(shù)（Peptide IPG IEF）是液相等電聚焦的重大發(fā)展。它利用傳統(tǒng)的2 DE分離儀器，在IPG 膠條上對肽段進行等電聚焦分離。2008年，Hubner等[6]采用Peptide IPG IEF代替膠內(nèi)酶解技術(shù)，將其引入蛋白質(zhì)組學分析中。同年，Chick等[7]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了鼠肝中的膜蛋白，他們通過此方法共發(fā)現(xiàn)了1549個非冗余膜蛋白。 2009年，McQuade等[8]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了人類胚胎干細胞，這種技術(shù)提高了蛋白檢測的覆蓋率，是一種有效的蛋白質(zhì)組學分析流程。 Peptide IPGIEF簡便易行，上樣量大（mg級），同時膠條上pH值穩(wěn)定，并且對肽段的提取和后續(xù)處理非常簡便，非常適合與LCMS/MS聯(lián)用，是一種非常有效的蛋白質(zhì)組學分離分析工具[7，9，10]。

本研究將Peptide IPG IEF分離分析技術(shù)運用于復雜生物樣品——鼠肝組織蛋白表達譜研究。利用Peptide IPGIEF良好的預分離能力和LTQ Orbitrap質(zhì)譜的高分辨能力，對大鼠肝臟組織全蛋白進行鑒定分析，同時也對其乙酰化修飾進行了鑒定。在大鼠鼠肝中共鑒定到2039個蛋白，其中鑒定到18個賴氨酸乙酰化修飾蛋白及18個賴氨基酸乙酰化修飾位點。在鑒定到的乙酰化蛋白中，包括4個新的乙酰化蛋白和8個新的乙酰化位點，這些結(jié)果也為乙酰化蛋白研究提供了重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和方法參考。 同時，本研究對樣品分離富集，降低樣品的復雜度，提高蛋白的上樣量，為無合適抗體的蛋白質(zhì)分析奠定基礎(chǔ)。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

等電聚焦儀；Protean II垂直電泳儀（BioRad公司）；真空冷凍干燥機（德國Christ公司）；MilliQ超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；系統(tǒng)： Nano Aquity液相色譜（Waters公司），納升級LC20AD（島津公司）。LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀（Thermo Fisher公司）。Peptide captrap C18色譜捕集柱 （2 mm×0.5 mm， Michrom公司）；Magic C18 AQ分析柱 （100 μm×150 mm，5 μm ，Michrom公司）。

pH 310 NL 18 cm IPG膠條， Ampholyte （GE Healthcare）； Trypsin （Proteomics Sequencing Grade Modified， Sigma公司）；蛋白酶抑制劑（Protease inhibitor cocktail，Roche公司）；TSA（Tocris Bioscience公司）；煙酰胺（US Biological公司）；其余試劑為進口或國產(chǎn)試劑分裝。色譜所用試劑均為HPLC級。

2.2實驗方法

實驗主要流程見圖1： 首先提取鼠肝全蛋白，用胰蛋白酶進行溶液酶解，得到的酶解肽段用18 cm 的pH 3～10 NL IPG 膠條進行Peptide IPG IEF分離，分離完全后將膠條分割為18份，并用0.1%甲酸溶液分別提取肽段，提取的肽段溶液用LCMS/MS分離鑒定，最后將得到的蛋白進行數(shù)據(jù)分析。

摘要 利用肽段固相膠條等電聚焦技術(shù)對大鼠鼠肝組織蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進行預分離，反相色譜分離所得預分離組分后，用LTQOrbitrap MS進行分析。共鑒定到2039個蛋白質(zhì)，包括18個乙酰化蛋白，其中4個乙酰化蛋白未被報道過。對這些蛋白進行了生物信息學分析。結(jié)果表明，將肽段等電聚焦與LCMS/MS結(jié)合起來，是一種有效的蛋白質(zhì)組學分析技術(shù)，適合于大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定分析。

關(guān)鍵詞 固相等電聚焦； 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用； 鼠肝蛋白質(zhì)

1引言

蛋白質(zhì)的分離與鑒定是蛋白質(zhì)組學研究的重要內(nèi)容，但由于生物樣品的復雜性，在進行蛋白鑒定分析前，往往需要預分離簡化體系后再進行鑒定分析。蛋白質(zhì)等電聚焦分離技術(shù)是一種有效的預分離方法，被用于蛋白質(zhì)組學研究中，取得了很好的成果[1～5]。但蛋白質(zhì)的液相等電聚焦在研究中存在一些問題，例如聚焦結(jié)束后需對分離的各組分蛋白質(zhì)分別酶解，溶液中pH值不穩(wěn)定，同時在線分析能力不強，所以科學家又發(fā)展了肽段固相等電聚焦的方法。

基于固相pH梯度（Immobilized pH gradients，IPG） 膠條的肽段等電聚焦分離技術(shù)（Peptide IPG IEF）是液相等電聚焦的重大發(fā)展。它利用傳統(tǒng)的2 DE分離儀器，在IPG 膠條上對肽段進行等電聚焦分離。2008年，Hubner等[6]采用Peptide IPG IEF代替膠內(nèi)酶解技術(shù)，將其引入蛋白質(zhì)組學分析中。同年，Chick等[7]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了鼠肝中的膜蛋白，他們通過此方法共發(fā)現(xiàn)了1549個非冗余膜蛋白。 2009年，McQuade等[8]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了人類胚胎干細胞，這種技術(shù)提高了蛋白檢測的覆蓋率，是一種有效的蛋白質(zhì)組學分析流程。 Peptide IPGIEF簡便易行，上樣量大（mg級），同時膠條上pH值穩(wěn)定，并且對肽段的提取和后續(xù)處理非常簡便，非常適合與LCMS/MS聯(lián)用，是一種非常有效的蛋白質(zhì)組學分離分析工具[7，9，10]。

本研究將Peptide IPG IEF分離分析技術(shù)運用于復雜生物樣品——鼠肝組織蛋白表達譜研究。利用Peptide IPGIEF良好的預分離能力和LTQ Orbitrap質(zhì)譜的高分辨能力，對大鼠肝臟組織全蛋白進行鑒定分析，同時也對其乙酰化修飾進行了鑒定。在大鼠鼠肝中共鑒定到2039個蛋白，其中鑒定到18個賴氨酸乙酰化修飾蛋白及18個賴氨基酸乙酰化修飾位點。在鑒定到的乙酰化蛋白中，包括4個新的乙酰化蛋白和8個新的乙酰化位點，這些結(jié)果也為乙酰化蛋白研究提供了重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和方法參考。 同時，本研究對樣品分離富集，降低樣品的復雜度，提高蛋白的上樣量，為無合適抗體的蛋白質(zhì)分析奠定基礎(chǔ)。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

等電聚焦儀；Protean II垂直電泳儀（BioRad公司）；真空冷凍干燥機（德國Christ公司）；MilliQ超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；系統(tǒng)： Nano Aquity液相色譜（Waters公司），納升級LC20AD（島津公司）。LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀（Thermo Fisher公司）。Peptide captrap C18色譜捕集柱 （2 mm×0.5 mm， Michrom公司）；Magic C18 AQ分析柱 （100 μm×150 mm，5 μm ，Michrom公司）。

pH 310 NL 18 cm IPG膠條， Ampholyte （GE Healthcare）； Trypsin （Proteomics Sequencing Grade Modified， Sigma公司）；蛋白酶抑制劑（Protease inhibitor cocktail，Roche公司）；TSA（Tocris Bioscience公司）；煙酰胺（US Biological公司）；其余試劑為進口或國產(chǎn)試劑分裝。色譜所用試劑均為HPLC級。

2.2實驗方法

實驗主要流程見圖1： 首先提取鼠肝全蛋白，用胰蛋白酶進行溶液酶解，得到的酶解肽段用18 cm 的pH 3～10 NL IPG 膠條進行Peptide IPG IEF分離，分離完全后將膠條分割為18份，并用0.1%甲酸溶液分別提取肽段，提取的肽段溶液用LCMS/MS分離鑒定，最后將得到的蛋白進行數(shù)據(jù)分析。