尺寸排阻色譜電感耦合等離子體質譜聯用測定功能飲料、多維片及奶粉中維生素B12

劉德曄　谷靜等

摘要 建立了固相微萃取（SPE）柱凈化，尺寸排阻色譜電感耦合等離子體質譜（SECICPMS）聯用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中維生素B12含量的方法，方法檢出限為 0.4 μg/L，維生素B12在1.0～150 μg/L范圍內線性良好，回歸系數R>0.999。實驗表明，乙腈作為維生素B12標準品溶劑可改善維生素B12的色譜行為，用乙腈作為SPE柱洗脫液比甲醇效果好。在嬰兒奶粉的前處理過程中，三氯甲烷作為蛋白沉淀劑得到的維生素B12回收率較高。功能飲料、多維片和3種嬰兒奶粉的檢測結果與商品標示值接近，相對標準偏差RSD均小于 5%（n=6），功能飲料、多維片的平均加標回收率為97%和90%，5種奶粉的平均加標回收率范圍為88%～92%，表明本方法能夠滿足日常分析的要求。

關鍵詞 尺寸排阻色譜，電感耦合等離子體質譜，維生素B12，嬰兒奶粉

1引言

維生素B12是一族含鈷的維生素，又稱鈷胺素，根據取代基的不同可分為氰鈷胺、甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺，高等動物無法自身合成鈷胺素，只能從食物中攝取，鈷胺素在紅細胞生成、神經系統發育及某些蛋白質的合成的過程中產生重要作用。鈷胺素中甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺均不穩定，添加于保健品和嬰兒奶粉中的鈷胺素為人工合成的氰鈷胺[1～3]，氰鈷胺是以鈷為中心的配合物，其分子量為1355.4，含鈷量為4.3%。中國國家標準規定嬰兒奶粉中必須添加維生素B12， 其含量范圍經換算后為10～72 ng/g， 市售嬰兒奶粉維生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。

目前，保健品中維生素B12測定國標方法為液相色譜法（HPLC）[5]，但HPLC方法因靈敏度較低，只適用于維生素B12含量較高的保健品的測定，無法實際測得含量在 ng/g級嬰兒奶粉中的維生素B12[6～8]，因此中國國家標準方法采用復雜且耗時的微生物法[9]測定。近年來，一些色譜質譜聯用技術（LCMS）嘗試測定傳統方法較難檢測的維生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白質，再用LCMS測得了維生素B12的含量，色譜保留時間約為9 min， 方法檢出限為2 ng/g，但基質干擾較為嚴重。Raju等[12]采用溶解離心取清液的方式提取早餐谷物和多維片中的維生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS聯用測定，保留時間為9 min，方法檢出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波輔助萃取的方式提取保健品中的維生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量測定，保留時間為9 min。Baker等[14]采用CEICPMS聯用的方法研究了各種鈷胺素的色譜行為。Guggisberg等[15]用免疫親和柱富集HPLC檢測的方法測定了肉類食品中維生素B12的含量，富集后的檢出限為2 ng/g。

近年來，色譜電感耦合等離子質譜聯用技術在食品、生物材料、環境等領域有有廣泛的應用[16～20]，它結合了色譜的高效分離優勢和電感耦合等離子體質譜的高靈敏度和低干擾的優點，除了用于形態分析， 還可用于傳統方法難測得的痕量組分的測定。本實驗采用固相微萃取柱富集SECICPMS聯用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中的人為添加的維生素B12。與傳統國標法相比， 本方法取樣量小、試劑人工消耗少、周期短，尤其對奶粉的測定具有獨特優勢，與基于C18柱的HPLCICPMS聯用的方法相比，本方法不需要會影響霧化效率的高濃度甲醇作為流動相，靈敏度高，峰型尖銳， 分析時間短，分析了文獻未嘗試較難測定的奶粉樣品[11，12]。隨著色譜電感耦合等離子體質譜聯用技術的普及，基于SECHPLCMS測定維生素B12的方法會得到廣泛的應用。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

LC20AB液相色譜儀（日本島津公司），BioSeps2000尺寸排阻色譜柱可分離0.87～300 kDa的物質（美國菲羅門公司）；X7電感耦合等離子體質譜儀及其工作站（美國Thermal）；色譜與ICPMS用Peek管相連，電子觸發采集數據；繪圖軟件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超純水凈化器（美國Millipore）；318型離心機（美國Sigma公司）；0.22 μm有機濾膜（中國楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美國Waters公司）。

鈷標準溶液1000 mg/L（美國Spex公司）；維生素B12（氰鈷胺，美國SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純；功能飲料、多維片、5個奶粉樣品采集于商場的品牌奶粉（編號1～5），所采集樣品已注明添加的維生素B12為氰鈷胺。

2.2SEC色譜條件以及ICPMS條件

2.2.1SEC色譜條件ICPMS在無加氧裝置的情況下不耐受有機流動相，因此本實驗流動相為無機磷酸緩沖鹽，但高濃度的磷酸緩沖鹽會使采樣錐和截取錐口處沉積鹽分，選擇低濃度磷酸鹽有利于保護儀器，最終實驗采用10 mmol/L磷酸鹽溶液作為流動相，流速為0.7 mL/min。

通常，高容量的定量環有利于提高靈敏度，但實驗在洗脫SPE柱時采用了有機溶劑，而進樣液中大量有機溶劑會使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量環后， 確定50 μL試液不會使ICPMS熄滅，實驗采用50 μL定量環。

2.2.2ICPMS條件選擇Co59作為定量同位素，經調諧儀器主要參數如表1所示。

摘要 建立了固相微萃取（SPE）柱凈化，尺寸排阻色譜電感耦合等離子體質譜（SECICPMS）聯用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中維生素B12含量的方法，方法檢出限為 0.4 μg/L，維生素B12在1.0～150 μg/L范圍內線性良好，回歸系數R>0.999。實驗表明，乙腈作為維生素B12標準品溶劑可改善維生素B12的色譜行為，用乙腈作為SPE柱洗脫液比甲醇效果好。在嬰兒奶粉的前處理過程中，三氯甲烷作為蛋白沉淀劑得到的維生素B12回收率較高。功能飲料、多維片和3種嬰兒奶粉的檢測結果與商品標示值接近，相對標準偏差RSD均小于 5%（n=6），功能飲料、多維片的平均加標回收率為97%和90%，5種奶粉的平均加標回收率范圍為88%～92%，表明本方法能夠滿足日常分析的要求。

關鍵詞 尺寸排阻色譜，電感耦合等離子體質譜，維生素B12，嬰兒奶粉

1引言

維生素B12是一族含鈷的維生素，又稱鈷胺素，根據取代基的不同可分為氰鈷胺、甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺，高等動物無法自身合成鈷胺素，只能從食物中攝取，鈷胺素在紅細胞生成、神經系統發育及某些蛋白質的合成的過程中產生重要作用。鈷胺素中甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺均不穩定，添加于保健品和嬰兒奶粉中的鈷胺素為人工合成的氰鈷胺[1～3]，氰鈷胺是以鈷為中心的配合物，其分子量為1355.4，含鈷量為4.3%。中國國家標準規定嬰兒奶粉中必須添加維生素B12， 其含量范圍經換算后為10～72 ng/g， 市售嬰兒奶粉維生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。

目前，保健品中維生素B12測定國標方法為液相色譜法（HPLC）[5]，但HPLC方法因靈敏度較低，只適用于維生素B12含量較高的保健品的測定，無法實際測得含量在 ng/g級嬰兒奶粉中的維生素B12[6～8]，因此中國國家標準方法采用復雜且耗時的微生物法[9]測定。近年來，一些色譜質譜聯用技術（LCMS）嘗試測定傳統方法較難檢測的維生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白質，再用LCMS測得了維生素B12的含量，色譜保留時間約為9 min， 方法檢出限為2 ng/g，但基質干擾較為嚴重。Raju等[12]采用溶解離心取清液的方式提取早餐谷物和多維片中的維生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS聯用測定，保留時間為9 min，方法檢出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波輔助萃取的方式提取保健品中的維生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量測定，保留時間為9 min。Baker等[14]采用CEICPMS聯用的方法研究了各種鈷胺素的色譜行為。Guggisberg等[15]用免疫親和柱富集HPLC檢測的方法測定了肉類食品中維生素B12的含量，富集后的檢出限為2 ng/g。

近年來，色譜電感耦合等離子質譜聯用技術在食品、生物材料、環境等領域有有廣泛的應用[16～20]，它結合了色譜的高效分離優勢和電感耦合等離子體質譜的高靈敏度和低干擾的優點，除了用于形態分析， 還可用于傳統方法難測得的痕量組分的測定。本實驗采用固相微萃取柱富集SECICPMS聯用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中的人為添加的維生素B12。與傳統國標法相比， 本方法取樣量小、試劑人工消耗少、周期短，尤其對奶粉的測定具有獨特優勢，與基于C18柱的HPLCICPMS聯用的方法相比，本方法不需要會影響霧化效率的高濃度甲醇作為流動相，靈敏度高，峰型尖銳， 分析時間短，分析了文獻未嘗試較難測定的奶粉樣品[11，12]。隨著色譜電感耦合等離子體質譜聯用技術的普及，基于SECHPLCMS測定維生素B12的方法會得到廣泛的應用。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

LC20AB液相色譜儀（日本島津公司），BioSeps2000尺寸排阻色譜柱可分離0.87～300 kDa的物質（美國菲羅門公司）；X7電感耦合等離子體質譜儀及其工作站（美國Thermal）；色譜與ICPMS用Peek管相連，電子觸發采集數據；繪圖軟件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超純水凈化器（美國Millipore）；318型離心機（美國Sigma公司）；0.22 μm有機濾膜（中國楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美國Waters公司）。

鈷標準溶液1000 mg/L（美國Spex公司）；維生素B12（氰鈷胺，美國SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純；功能飲料、多維片、5個奶粉樣品采集于商場的品牌奶粉（編號1～5），所采集樣品已注明添加的維生素B12為氰鈷胺。

2.2SEC色譜條件以及ICPMS條件

2.2.1SEC色譜條件ICPMS在無加氧裝置的情況下不耐受有機流動相，因此本實驗流動相為無機磷酸緩沖鹽，但高濃度的磷酸緩沖鹽會使采樣錐和截取錐口處沉積鹽分，選擇低濃度磷酸鹽有利于保護儀器，最終實驗采用10 mmol/L磷酸鹽溶液作為流動相，流速為0.7 mL/min。

通常，高容量的定量環有利于提高靈敏度，但實驗在洗脫SPE柱時采用了有機溶劑，而進樣液中大量有機溶劑會使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量環后， 確定50 μL試液不會使ICPMS熄滅，實驗采用50 μL定量環。

2.2.2ICPMS條件選擇Co59作為定量同位素，經調諧儀器主要參數如表1所示。

摘要 建立了固相微萃取（SPE）柱凈化，尺寸排阻色譜電感耦合等離子體質譜（SECICPMS）聯用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中維生素B12含量的方法，方法檢出限為 0.4 μg/L，維生素B12在1.0～150 μg/L范圍內線性良好，回歸系數R>0.999。實驗表明，乙腈作為維生素B12標準品溶劑可改善維生素B12的色譜行為，用乙腈作為SPE柱洗脫液比甲醇效果好。在嬰兒奶粉的前處理過程中，三氯甲烷作為蛋白沉淀劑得到的維生素B12回收率較高。功能飲料、多維片和3種嬰兒奶粉的檢測結果與商品標示值接近，相對標準偏差RSD均小于 5%（n=6），功能飲料、多維片的平均加標回收率為97%和90%，5種奶粉的平均加標回收率范圍為88%～92%，表明本方法能夠滿足日常分析的要求。

關鍵詞 尺寸排阻色譜，電感耦合等離子體質譜，維生素B12，嬰兒奶粉

1引言

維生素B12是一族含鈷的維生素，又稱鈷胺素，根據取代基的不同可分為氰鈷胺、甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺，高等動物無法自身合成鈷胺素，只能從食物中攝取，鈷胺素在紅細胞生成、神經系統發育及某些蛋白質的合成的過程中產生重要作用。鈷胺素中甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺均不穩定，添加于保健品和嬰兒奶粉中的鈷胺素為人工合成的氰鈷胺[1～3]，氰鈷胺是以鈷為中心的配合物，其分子量為1355.4，含鈷量為4.3%。中國國家標準規定嬰兒奶粉中必須添加維生素B12， 其含量范圍經換算后為10～72 ng/g， 市售嬰兒奶粉維生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。

目前，保健品中維生素B12測定國標方法為液相色譜法（HPLC）[5]，但HPLC方法因靈敏度較低，只適用于維生素B12含量較高的保健品的測定，無法實際測得含量在 ng/g級嬰兒奶粉中的維生素B12[6～8]，因此中國國家標準方法采用復雜且耗時的微生物法[9]測定。近年來，一些色譜質譜聯用技術（LCMS）嘗試測定傳統方法較難檢測的維生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白質，再用LCMS測得了維生素B12的含量，色譜保留時間約為9 min， 方法檢出限為2 ng/g，但基質干擾較為嚴重。Raju等[12]采用溶解離心取清液的方式提取早餐谷物和多維片中的維生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS聯用測定，保留時間為9 min，方法檢出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波輔助萃取的方式提取保健品中的維生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量測定，保留時間為9 min。Baker等[14]采用CEICPMS聯用的方法研究了各種鈷胺素的色譜行為。Guggisberg等[15]用免疫親和柱富集HPLC檢測的方法測定了肉類食品中維生素B12的含量，富集后的檢出限為2 ng/g。

近年來，色譜電感耦合等離子質譜聯用技術在食品、生物材料、環境等領域有有廣泛的應用[16～20]，它結合了色譜的高效分離優勢和電感耦合等離子體質譜的高靈敏度和低干擾的優點，除了用于形態分析， 還可用于傳統方法難測得的痕量組分的測定。本實驗采用固相微萃取柱富集SECICPMS聯用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中的人為添加的維生素B12。與傳統國標法相比， 本方法取樣量小、試劑人工消耗少、周期短，尤其對奶粉的測定具有獨特優勢，與基于C18柱的HPLCICPMS聯用的方法相比，本方法不需要會影響霧化效率的高濃度甲醇作為流動相，靈敏度高，峰型尖銳， 分析時間短，分析了文獻未嘗試較難測定的奶粉樣品[11，12]。隨著色譜電感耦合等離子體質譜聯用技術的普及，基于SECHPLCMS測定維生素B12的方法會得到廣泛的應用。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

LC20AB液相色譜儀（日本島津公司），BioSeps2000尺寸排阻色譜柱可分離0.87～300 kDa的物質（美國菲羅門公司）；X7電感耦合等離子體質譜儀及其工作站（美國Thermal）；色譜與ICPMS用Peek管相連，電子觸發采集數據；繪圖軟件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超純水凈化器（美國Millipore）；318型離心機（美國Sigma公司）；0.22 μm有機濾膜（中國楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美國Waters公司）。

鈷標準溶液1000 mg/L（美國Spex公司）；維生素B12（氰鈷胺，美國SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純；功能飲料、多維片、5個奶粉樣品采集于商場的品牌奶粉（編號1～5），所采集樣品已注明添加的維生素B12為氰鈷胺。

2.2SEC色譜條件以及ICPMS條件

2.2.1SEC色譜條件ICPMS在無加氧裝置的情況下不耐受有機流動相，因此本實驗流動相為無機磷酸緩沖鹽，但高濃度的磷酸緩沖鹽會使采樣錐和截取錐口處沉積鹽分，選擇低濃度磷酸鹽有利于保護儀器，最終實驗采用10 mmol/L磷酸鹽溶液作為流動相，流速為0.7 mL/min。

通常，高容量的定量環有利于提高靈敏度，但實驗在洗脫SPE柱時采用了有機溶劑，而進樣液中大量有機溶劑會使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量環后， 確定50 μL試液不會使ICPMS熄滅，實驗采用50 μL定量環。

2.2.2ICPMS條件選擇Co59作為定量同位素，經調諧儀器主要參數如表1所示。