感染對糖尿病大鼠病理狀態(tài)的影響＊

王彥江，謝席勝，馮勝剛，龍瓊先

（川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院 1．腎內(nèi)科，2．病理科，四川 南充637000）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常見的微血管并發(fā)癥之一。然而其發(fā)病機制至今仍未完全闡明。因此，建立理想的DM實驗動物模型是研究DKD發(fā)病及防治機制的重要手段。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，DM大鼠常常發(fā)生感染，并且DM模型大鼠的腎臟病變在剔除感染前后存在差異，現(xiàn)將我們的研究報告如下。

1 實驗材料

1．1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠100只，8周齡，體重（200±20）g，購自川北醫(yī)學院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK（川）2008－1B。適應性飼養(yǎng)1w后進行實驗，12h晝夜交替，自由進水進食。動物室溫度控制在21℃～25℃，濕度控制在65%～69%。

1．2 實驗試劑 廣衡電子計重秤（廣衡電子衡器有限公司生產(chǎn)），編號：粵制00000547，由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供；大鼠代謝籠（北京萊爾凈化設備有限公司）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma公司，美國），規(guī)格：1g／瓶（滅菌裝），2～8℃保存，購自北京市博愛港商貿(mào)有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉，購自北京市博愛港商貿(mào)有限公司；三諾安穩(wěn)血糖儀以及三諾安慰血糖試紙（長沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司）；75%消毒酒精；高爾寶目測尿糖試紙（廣州市花都高爾寶生物技術(shù)有限公司）；肌酐試劑盒、尿素氮試劑盒（上海科華生物工程股份有限公司）；HITACHI全自動生化分析儀（日立儀器（蘇州）有限公司）：儀器型號：7600－010，由南充市中心醫(yī)院提供。全自動尿液干化學分析儀（日本京都），儀器型號：AX－4280由南充市中心醫(yī)院提供。HM315輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機（廣州市炳陽生物科技有限公司）：型號：HM315，由南充市中心醫(yī)院病理科提供；BMJ－A型包埋機及病理組織包埋冷卻臺（常州市中威電子儀器有限公司）：型號：BMJ－A型，由南充市中心醫(yī)院病理科提供。

2 實驗與統(tǒng)計方法

2．1 實驗分組及造模 雄性SD大鼠100只，隨機分為正常對照組（10只）和實驗組（90只）。適應性喂養(yǎng)1周后，造模前將大鼠禁食 12h［2］，將 STZ 用 0．01mmol／L、PH為4．5的檸檬酸鈉緩沖液配成1%的濃度，以65mg／kg體質(zhì)量行一次性腹腔注射［1］，正常對照組則注射等量的檸檬酸鹽緩沖液腹腔注射。DM造模標準［2］：72小時后檢測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），以FBG≥16．7mmol的大鼠視為造模成功。根據(jù)造模標準，從實驗組篩選出DM模型大鼠。通過對腎臟、肺臟的解剖發(fā)現(xiàn)以及小便常規(guī)是否存在著尿路感染等指標判定大鼠是否有感染的發(fā)生。以此，在隨后的實驗研究中，將感染大鼠排除在外。

2．2 指標檢測及方法

2．2．1 一般情況 觀察各組大鼠的一般狀況，如進食、飲水量、小便量，色以及氣味等。

2．2．2 生化指標檢測 采用血糖儀及配套血糖試紙進行血糖監(jiān)測，檢測前禁食8小時，各組大鼠經(jīng)剪尾尖放血法檢測FPG；采用肌氨酸氧化酶法和紫外－谷氨酸脫氫酶法檢測分別測定血清肌酐及尿素氮指標；采用尿糖試紙對尿糖水平進行半定量檢測；實驗結(jié)束前24小時，將大鼠放入代謝籠中，收集各組大鼠尿液，記錄尿量并送至我院檢驗科做尿常規(guī)及24小時尿蛋白定量檢測。

2．2．3 腎臟肥大指數(shù)（kidney hypertrophy index，KHI） 全部大鼠摘取左腎，用分析天平稱重，計算KHI，KHI＝［腎重（g）／體重（g）］×1000‰。

2．2．4 普通光學顯微鏡觀察 采用3%的戊巴比妥鈉，按0．1ml／100g體質(zhì)量腹腔注射麻醉后，處死大鼠。收取各組大鼠的腎臟及肺臟標本，將腎臟稱重后去除包膜。此時，將肺臟以及去除包膜的腎臟浸泡于10%中性甲醛溶液，固定12小時，作常規(guī)石蠟包埋組織塊，5μm超薄切片，腎臟、肺臟行HE染色，光鏡下觀察腎臟、肺臟的病理改變。每張片子隨機選取20個腎小球，每個腎小球按標準計分，然后取20個記分的均值作為該片腎小球系膜增生分級數(shù)。0級：正常腎小球（記0分）；Ⅰ 級：增生的系膜組織對腎小球毛細血管袢無明顯影響，系膜增生寬度小于毛細血管直徑，呈節(jié)段性分布（記2分）；Ⅱ級：增生的系膜組織對腎小球毛細血管袢有一定的壓迫和破壞作用，系膜增生寬度大于毛細血管直徑，呈彌漫性分布（記4分）；Ⅲ級：增生的系膜組織對腎小球毛細血袢有一定的壓迫和破壞作用，系膜增生呈結(jié)節(jié)狀或團塊狀，彌漫性分布且階段性加重［3］。采用 WinROOF圖像處理軟件（MitaniCorp．）評估小管間質(zhì)的損害程度［4］，每張切片選取10個視野，計算皮質(zhì)部每一視野中小管擴張、間質(zhì)浸潤以及纖維化區(qū)域所占的百分率。得分情況為0～5分：0，正常間質(zhì)；1，＜10%的區(qū)域損傷；2，11%～25%的區(qū)域損傷；3，26%～50%的區(qū)域損傷；51%～75%的區(qū)域損傷；＞76%的區(qū)域損傷。

2．3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析處理，計量資料以表示，兩組之間的均值比較采用t檢驗；以P＜0．05，認為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3．1 各組大鼠一般情況 腹腔注射STZ誘導后，正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動自如，反應靈敏，毛色光滑；DM組大鼠毛色粗糙，精神較差，反應較遲鈍，活動差，脊柱呈弓背樣彎曲。并且，DM組大鼠尿液的泡沫較多，酸臭味更加明顯。正常對照組大鼠無感染的發(fā)生，DM組大鼠感染的發(fā)生率為35．7%，并且DM組大鼠常常合并多種感染發(fā)生，其中有2只為尿路感染合并腎膿腫及肺部感染，有3只為單純性尿路感染，有6只為單純性腎膿腫，有1只為單純性肺部感染。DM模型中感染大鼠的死亡率為80%。如圖1所示，正常對照組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞基底膜分布正常，毛細血管腔開放，肺間質(zhì)無炎癥細胞浸潤。發(fā)生肺部感染的DM大鼠的肺臟表現(xiàn)為嚴重的肺水腫，病理表現(xiàn)為肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞基底膜明顯增厚，肺泡間隔增寬，間質(zhì)中膠原和彈性蛋白含量增多，部分肺泡腔萎縮甚至塌陷，部分肺泡腔內(nèi)有多量炎癥細胞浸潤，并可見片狀壞死。發(fā)生尿路感染大鼠的尿常規(guī)表現(xiàn)為較高的紅細胞及白細胞水平，腎臟病理中可見大量的炎癥細胞中浸潤，膿腫及壞死形成等。解剖時也發(fā)現(xiàn)，發(fā)生尿路感染的大鼠腎臟與周圍組織界限模糊，有膿腔存在等。與正常對照組相比，DM組大鼠的進食量、尿量以及飲水量均顯著增加；然而，與剔除感染前相比，剔除后的DM組大鼠的進食量較高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），結(jié)果見表1。

3．2 各組大鼠血糖情況 與正常對照組相比，DM組大鼠的FPG水平顯著升高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05）；與剔除感染前相比，剔除后DM組大鼠的FPG水平稍低，但不具有統(tǒng)計學差異（P＞0．05），見表2。

3．3 各組大鼠體重、腎功情況 與正常對照組相比，DM組大鼠的體重水平較低，而KHI較高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與剔除感染前組相比，剔除感染后DM組大鼠的KHI較低，具有統(tǒng)計學差異。與正常對照組相比，DM組大鼠的肌酐和尿素氮水平均較高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與剔除感染前組相比，剔除感染后DM組大鼠的肌酐及尿素氮水平較低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），結(jié)果詳見圖2。

表1 剔除感染前后各組大鼠的一般情況Table 1 General situation of rats of all groups before and after the removal of infection

圖1 各組大鼠的肺臟及病理Figure 1 Lungs and pathology of rats of groups

表2 剔除感染前后各組大鼠的FPG及尿糖水平Table 2 Level of FPG and urinary glucose in rats of all groups before and after the removal of infection

3．4 各組大鼠尿常規(guī)及24小時尿蛋白定量 與對照組相比，DM組大鼠尿常規(guī)中的紅細胞、白細胞水平以及24小時尿蛋白定量均顯著增高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05）；與剔除感染前組相比，剔除感染后DM組大鼠尿常規(guī)中的紅細胞、白細胞水平較低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。與剔除感染前相比，剔除感染后DM組大鼠24小時尿蛋白定量水平較低，但不具有統(tǒng)計學意義（P＞0．05），結(jié)果見表3。

圖2 A 剔除感染前后各組大鼠的體重及KHI水平Figure 2A Level of Weight and KHI in rats of all groups before and after the removal of infection

圖2 B 剔除感染前后各組大鼠的腎功水平Figure 2B Level of renal function in rats of all groups before and after the removal of infection

表3 剔除感染前后各組大鼠的尿常規(guī)及24小時尿蛋白定量情況Table 3 Urine routine and 24－h(huán)our urinary protein excretion in rats of all groups before and after the removal of infection

3．5 各組大鼠的腎臟病理情況 解剖時發(fā)現(xiàn)正常對照組及DM非感染大鼠的腎臟與周圍組織的解剖層次結(jié)構(gòu)清晰，易于分離。DM感染大鼠的腎臟體積明顯增大，腎臟與周圍組織廣泛粘連，表面凹凸不平，呈顆粒狀，切開時發(fā)現(xiàn)腎臟上下極常存在單個或多個膿腔，內(nèi)含乳白色液體，見圖3。正常對照組的腎組織病理未見明顯病變；DM非感染大鼠腎病理：系膜基質(zhì)輕度增生，可見少許腎小管上皮細胞空泡變性；然而，同期的DM感染大鼠腎病理表現(xiàn)為系膜基質(zhì)中度增生，Cap袢開放尚可，腎小管上皮細胞空泡變性及壞死，間質(zhì)內(nèi)可見大量淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，伴出血壞死以及膿腫形成（圖4）。與正常對照組相比，DM組大鼠腎臟的系膜增生程度以及小管間質(zhì)損害程度均較高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05）。同時，與剔除感染前組相比，剔除感染后DM組大鼠的腎臟系膜增生程度評分以及小管間質(zhì)損害程度評分均較低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），結(jié)果見表4。

4 討論

DM患者由于存在血糖升高、蛋白質(zhì)代謝紊亂、免疫功能低下以及機體抵抗力降低等諸多因素，因此DM患者極易發(fā)生各種感染。DM合并感染的發(fā)生率為32．7%～90．5%［5］，其中泌尿系統(tǒng)感染占36．1%，呼吸系統(tǒng)感染占24．6%，其次為皮膚及軟組織感染，

表4 剔除感染前后各組大鼠腎臟的病理評分Table 4 Renal pathological score of rats of all groups before and after the removal of infection

胃腸道及其他感染等［6］。在我們的研究中，DM組大鼠感染的發(fā)生率為35．7%，并且DM組大鼠常常合并多種感染發(fā)生，其中有2只為尿路感染合并腎膿腫及肺部感染，有3只為單純性尿路感染，有6只為單純性腎膿腫，有1只為單純性肺部感染，而正常對照組則無感染的發(fā)生。DM模型中感染大鼠的死亡率為80%。發(fā)生肺臟感染的大鼠表現(xiàn)為肺臟的極度水腫，肺病理也表現(xiàn)為大量的炎癥細胞浸潤、膿腫及壞死形成等。發(fā)生尿路感染的大鼠表現(xiàn)，尿常規(guī)表現(xiàn)紅細胞及白細胞計數(shù)的增加，解剖結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎臟存在彌漫性的水腫和大量膿腔。同時，病理結(jié)果也證實感染大鼠腎臟組織中存在嚴重的炎癥細胞浸潤以及壞死膿腫形成等。

5 結(jié)論

圖3 各組大鼠腎臟外觀Figure 3 Kidney appearance of rats of all groups

圖4 各組大鼠腎臟病理Figure 4 Renal pathology of rats of all groups

我們的研究發(fā)現(xiàn)，剔除感染后DM組大鼠的進食量明顯增加，而在KHI、肌酐及尿素氮水平、尿常規(guī)中的紅細胞及白細胞方面以及腎臟系膜增生程度評分和小管間質(zhì)損害程度評分方面均降低。并且，剔除感染后，DM組大鼠的24小時尿蛋白定量方面有所降低。DM大鼠與人類糖尿病一樣同樣容易發(fā)生感染，且感染部位以腎臟、尿路和肺部為主。DM足病患者尿蛋白的排泄量隨著足部感染程度的加重而增多［7］。在慢性乙肝病毒感染及人免疫缺陷病毒感染患者中，活動性炎癥可引起并加重尿蛋白排泄，同時適度控制感染會減少尿蛋白排泄［8］。由此推測，感染可能是加重腎病進展的一個重要危險因素。

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