CD47在單側輸尿管梗阻大鼠模型中調控血管生成的作用研究＊

夏夢迪，謝席勝，馮勝剛

（1．瀘州醫學院附屬醫院腎臟內科，四川 瀘州646000；2．川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院腎內科，四川 南充637000）

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）被認為是慢性腎臟病進展到終末期腎衰（end stage renal disease，ESRD）的共同通路和最主要病理改變之一。RIF主要表現為細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）在腎間質過度沉積、腎小管間質破壞和腎小管周圍毛細血管（peritubular capillary，PTC）丟失［1］。其中，PTC的喪失與RIF的嚴重程度密切相關。TSP－1的常見受體CD47是一種整合素相關蛋白，分子量為40～55kDa。在RIF病變過程中TSP－1是否通過其受體CD47參與抑制血管生成，值得關注。本研究通過免疫組化檢測TSP－1、CD47、VEGF在單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型中的表達，并初步研究這些細胞因子與PTC的關系，探討TSP－1受體CD47在調控抑制血管生成的作用及機制。

1 材料和方法

1．1 試劑和儀器 3%戊巴比妥鈉（由川北醫學院動物中心提供）；TSP－1抗體（批號BA2130，購自博士德生物工程有限公司）；CD47（批號BS－2386R，購自博奧森生物技術有限公司）、VEGF（批號BA0407，購自博士德生物工程有限公司）、CD34（批號BA0532，購自博士德生物工程有限公司）。兔SP免疫組化染色試劑盒（北京中杉，批號SP－9001）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1．2 實驗動物和分組 清潔、健康SD大鼠75只，體重180～200g，購自川北醫學院動物實驗中心。將大鼠隨機分為假手術組（SOR組）25只和模型組（UUO組）50只。UUO組隨機分為5個時間點，分別為術后3天、7天、14天、21天和28天，每小組10只。SOR組按相同時間點隨機分組，每組5只。

1．3 建立動物模型 術前使用5%水合氯醛，按6ml／kg腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠按右側臥位固定于手術臺上，局部剃毛后，常規碘酒、75%酒精消毒，選擇左側腹切口，逐層切開，進入腹腔，分離左側輸尿管。用止血鉗夾閉輸尿管中段，并用4－0絲線于左側輸尿管兩端，兩次結扎其近腎盂段，剪斷輸尿管，連續縫合皮膚，即為UUO動物模型。SOR組只切開腹腔和游離左側輸尿管，不進行結扎和剪斷。

1．4 病理檢查 各組大鼠處死后取左腎組織，保存于10%多聚甲醛液中固定48h，石蠟包埋切片，經常規蘇木精－伊紅（HE）染色，觀察腎組織病理學改變。根據文獻描述方法，進行腎小管間質損傷半定量評分［2］和腎間質浸潤炎細胞計數［3］。

1．5 免疫組化 采用SP法進行檢測，觀察腎臟TSP－1、CD47、VEGF的表達。以CD34代表PTC的表達。4μm石蠟切片，常規脫蠟下水，高壓鍋修復后滴加3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶。正常山羊血清37℃孵育封閉。加一抗4℃過夜。加入生物素標記山羊抗兔IgG 37℃孵育。加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37℃孵育。期間均用pH＝7．2的磷酸鹽緩沖液反復沖洗。DAB顯色，蘇木素復染，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每次以PBS代替一抗作替代陰性對照。

采用Image Pro plus多媒體彩色病理圖像分析軟件進行分析。分別計算每例切片4個不重疊的400倍視野中，腎小管 TSP－1、CD47、VEGF、CD34陽性染色平均光密度值（integral optical density，IOD），取平均值，并做統計分析。

1．6 統計學處理 采用SPSS 13．0軟件處理。資料采用ˉx±s表示。組間差異選單因素方差分析，用SNK檢驗法進行組間兩兩比較。數據之間的關系采用Pearson相關分析。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 實驗動物存活情況 UUO組大鼠1只術后麻醉過度未清醒，2只于術后一天死亡，對其解剖發現腹腔出血嚴重，死亡可能與傷及腹腔血管有關。另5只分別于術后第2、7、8、11、17天進食逐漸減少后相繼死亡，剖開腹腔可見明顯感染灶。SOR組1只大鼠術后未清醒，2只大鼠術后進食減少，分別在第4天和第10天死亡。共統計納入大鼠64只（UUO組，n＝42；SOR組，n＝22）。

2．2 腎組織病理改變 HE染色顯示，SOR組腎皮、髓質結構正常，腎小管間質及腎小球未見異常，無明顯充血及炎細胞浸潤。UUO術后3d可見腎小管明顯擴張，空泡變性、炎癥細胞浸潤。UUO術后7d即可觀察到明顯的腎間質纖維化的表現如腎間質增寬、膠原沉積增加、腎小管萎縮等。術后14～21d，上述纖維化的征象更加明顯。腎小管損傷程度評分顯示，UUO各組較SOR組腎小管損傷評分隨時間延長逐漸升高，結果見圖1～3。

2．3 PTC（CD34）及VEGF的變化 免疫組化結果顯示，SOR組：腎小球、腎小管結構均正常，CD34在腎小球毛細血管內皮細胞和腎小管上皮細胞中廣泛表達，VEGF廣泛存在于腎小管上皮細胞及細胞胞漿中；UUO 3天組：腎小管輕度擴張，腎小球、腎小管CD34表達減弱，VEGF表達也較前減少；UUO 7天組：腎小管擴張加劇，腎小管上皮細胞CD34、VEGF陽性表達進一步減少；UUO 14天組：腎小管擴張呈囊狀，部分小管壞死，很少部分腎小管表達CD34，VEGF也只少量表達；UUO 21天組：腎小管減少，間質纖維化，殘存腎小管表達少量CD34，少許腎小管上皮細胞表達VEGF；UUO 28天組：腎小球損傷輕微，腎小管減少，間質纖維化，CD34在腎小球毛細血管表達，腎小管CD34和VEGF的表達極少，結果見表1。

2．4 TSP－1、CD47的表達 免疫組化結果顯示，SOR組：腎小管結構正常，無TSP－1表達，無CD47表達；UUO 3天組：腎小管腫脹，部分腎小管上皮細胞胞漿中TSP－1和CD47表達；UUO 7天組：腎小管擴張，部分空泡變性，大部分腎小管上皮細胞胞漿中TSP－1和CD47表達；UUO 14天組：腎小管擴張呈囊狀，萎縮的腎小管上皮見TSP－1表達，部分壞死脫落到管腔的上皮細胞可見TSP－1陽性著色，萎縮的腎小管上皮有CD47表達，部分間質見CD47表達；UUO 21天組：腎小管減少，腎小管上皮細胞和纖維化明顯的間質TSP－1表達，纖維化的間質CD47增加；UUO 24天組：腎小管減少，間質纖維化顯著，TSP－1在纖維化顯著的間質表達，CD47表達進一步增加，結果見表1。

圖1 UUO大鼠腎組織病理改變（HE×100）Fig．1 Histological examination in rats with UUO（HE×100）

圖2 炎細胞計數變化Fig．2 Change of inflammatory cell

圖3 腎小管損傷評分Fig．3 Score of renal interstitial lesion

表1 各組大鼠腎小管免疫組化指標積分光密度（IOD，±s）Table1 Immunohistochemical level of IOD in rats with UUO

表1 各組大鼠腎小管免疫組化指標積分光密度（IOD，±s）Table1 Immunohistochemical level of IOD in rats with UUO

注：與假手術組相比：①P＜0．05，與 UUO 3天組相比：②P＜0．05；

組別 n CD34 Tsp－1 CD47 VEGF 22 12．00±1．94 0 0 86．19±13．22 UU O3天組 9 6．03±0．89① 6．96±2．24① 0．81±0．21① 56．62±5．34①UUO 7天組 9 4．24±0．53①② 11．95±1．99①② 1．39±0．19①② 41．08±3．30①②UUO 14天組 7 2．83±0．31①② 19．23±1．77①② 1．77±0．12①② 30．52±2．08①②UUO 21天組 8 1．80±0．33①② 27．51±3．78①② 2．40±0．25①② 21．66±2．64①②UUO 28天組 9 0．78±0．28①② 22．34±2．22①② 2．91±0．13①② 10．93±3．15 SOR組①②

2．5 相關性分析 相關分析顯示CD47的表達與CD34的表達呈負相關（r＝－0．925，P＜0．01），與VEGF表達也呈負相關（r＝－0．946，P＜0．01），見圖4。

圖4 相關性分析Fig．4 Correlation analysis

3 討論

UUO模型由于其造模簡便，重復性高，可在短期內形成腎臟纖維化，是研究腎間質纖維化發病機制的理想模型。隨著UUO時間的延長，病理切片顯示腎小管出現了變性和壞死，間質炎性細胞浸潤，且后期出現纖維化，然而腎小球損傷指標蛋白尿未出現明顯差異，該結果與既往文獻結果一致［4］。PTC病變與間質炎癥以及隨后纖維化的發生密切相關［5］。

腎臟毛細血管網的退化起因于內皮細胞丟失的增加以及損傷性的退化［6］。在這個過程中，具有促進血管生成的VEGF及具有抑制血管生成的TSP－1的地位一直倍受關注［7］。TSP－1的抗血管生成功能主要歸因于3’N－末端I型凝血酶敏感蛋白重復序列（3TSR）和C－末端片段，分別通過兩個主要受體CD36和CD47發揮抗血管的生成作用［8］。研究發現，CD36是角膜中TSP－1抑制血管生成所必需的［9］，但在血管細胞中TSP－1抑制血管生成需要的受體是CD47而不是CD36［10］。隨著腎臟纖維化進程的進展，VEGF的表達逐漸下降，而TSP－1的表達卻逐漸增強，這與文獻報道一致［11］。TSP－1的受體CD47也在大鼠小管間質大量表達，且其表達模式與TSP－1一致。相關性分析證實，CD47積分光密度與CD34積分光密度及VEGF積分光密度均呈負相關。

4 結論

TSP－1與它的受體CD47結合，可能通過調控內皮細胞VEGF信號的傳導，參與了UUO大鼠模型RIF過程中PTC病變的發生和發展。TSP－1與其受體CD47在RIF過程中PTC病變中的作用，值得進一步研究。

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