血清鈣調蛋白與急性缺血性腦卒中的相關性研究

劉建平，孔小燕

（1．河北聯合大學基礎醫學院，河北 唐山063000；2．唐鋼醫院神經內科，河北 唐山063000）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）目前已成為影響人類健康的常見病、多發病，其特征是病死率、致殘率和復發率高，大大降低了患者的生活質量。大量研究證實IS后患者病情加重的主要原因與腦缺血再灌注損傷有直接關系。如何減輕腦缺血后神經細胞再灌注損傷是丞待解決的重要問題，而目前認為導致腦細胞損傷的關鍵環節是細胞內鈣超載［1］。因體內Ca2＋依賴的多種激酶的功能受CAM的調節，所以CAM參與了體內多種疾病的生理病理過程。本文旨在研究卒中后CAM水平與腦梗死面積的關系，探討是否可將IS后48小時CAM值作為最佳測量值，是否與急性期病情嚴重程度呈正相關，是否可作為一重要指標指導臨床治療。

1 對象和方法

1．1 研究對象 包括兩部分，一部分為本院健康體檢者，共100例，并排除心肝腎重大疾病及嚴重感染性疾病史。另一部分為2012年1月至2013年10月在唐鋼醫院住院的120例急性IS患者。所有患者均依照第四屆全國腦血管病學術會議診斷標準經臨床表現、CT 和（或）MRI確診［4］。

1．2 實驗方法

1．2．1 分組方法 將100例本院健康體檢者設為正常對照組，其中男性52例，女性48例，平均年齡（61．2±9．4）歲。實驗組為120例急性IS患者。其中男性66例，女性54例，平均年齡（62．6±11．6）歲。兩組患者年齡、性別比較差異無統計學意義（P＞0．05）。其次，由兩名神經科醫師對入組的IS患者在卒中后48小時依據頭顱CT計算腦梗死面積，按照Adamas分類法再將實驗組的IS患者分為（三個亞組）大梗死組（腦梗死灶面積＞3cm2，并累及2個以上腦解剖部位的大血管主干供血區）27例；小梗死組（腦梗死面積在1．5～3．0cm2之間）42例及腔隙性腦梗死組（腦梗死面積＜1．5cm2）51例，三組患者年齡、性別比較差異，無統計學意義（P＞0．05）。

1．2．2 標本采集及處理 入選的急性IS患者在卒中后（2h、3h、6h、24h、48h、72h、6d、10d）采集靜脈血測定血清鈣調蛋白水平。對照組采清晨空腹靜脈血。所有標本均使用生化真空促凝管采集，并在4℃冰箱中保存1d后離心，取血清1ml保存于－20℃冰箱中。

1．2．3 血清CAM檢測 取出保存于－20℃冰箱中備用血清標本，置于室溫融化，并平衡30分鐘。CAM試劑盒購于上海艾萊薩生物科技有限公司。采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附法（ELISA），應用美國EVOLIS全自動酶免分析儀進行測定。

1．3 統計學處理 采用SPSS 13．0統計學軟件進行數據分析。計量資料正態分布變量以均數±標準差（±s）描述；分類資料用百分比描述。各組間比較：分類變量采用卡方檢驗，連續變量為正態分布兩組間比較采用t檢驗。P＜0．05表示差異有統計學意義。

2 結果

2．1 CAM最佳測量值的確定 通過研究卒中后不同時段鈣調蛋白水平變化后發現，CAM值在卒中后2～3小時開始上升，直至2～3天達高峰，在6天左右降至正常水平。說明卒中后48～72小時血清CAM濃度更能反映急性期病情輕重程度。故本研究所選用的CAM值均為IS后48小時的血清測定值。以下為卒中后不同時段CAM值變化趨勢圖，見圖1。

圖1 卒中后不同時段CAM值變化趨勢圖Fig．1 The trend chart of CAM values at different period after stroke

2．2 實驗組與對照組CAM值比較 IS組患者血清CAM值均較正常對照組顯著增高（P＜0．001），有統計學意義，見表1。

表1 兩組患者血清CAM水平的比較（±s）Table 1 Comparison of two groups of serum calmodulin levels

表1 兩組患者血清CAM水平的比較（±s）Table 1 Comparison of two groups of serum calmodulin levels

注：與對照組比較P＜0．001

組別n CAM（ng／ml）（images/BZ_21_1545_1514_1573_1567.png±s）t P對照組 100 88．98±23．41 15．34 ＜0．001實驗組120 188．7±75．32

2．3 腦梗死面積組CAM值比較 三組患者血清CAM 水平比較有顯著差異（F＝260．89，P＜0．001），有統計學意義。經Pearson相關分析發現三組IS患者血清CAM水平與梗死面積呈正相關關系（r＝0．616，P＜0．05），見表2。

表2 實驗組中三個亞組患者血清CAM測定值比較Table 2 Comparison of serum calmodulin levels

3 討論

急性缺血性卒中是目前發病率、致殘率及復發率極高的疾病。腦缺血再灌注損傷的發生機制十分復雜，而目前認為導致腦細胞損傷的關鍵環節是細胞內鈣超載［1］。CAM 是細胞內功能最重要的鈣受體蛋白，在缺血性腦卒中再灌注損傷時不但對神經細胞內鈣超載起著關鍵的調控作用，而且對大量自由基生成、NO釋放、興奮性氨基酸等神經遞質的釋放、凋亡基因的激活等有直接或間接影響［3］。CaM是目前研究得功能最重要的一種Ca2＋結合蛋白，體內Ca2＋依賴的多種激酶的功能受鈣調蛋白調節，因其參與了體內多種疾病的生理病理過程［4～6］。最近Swarnkar S通過研究發現，魚藤酮通過增加細胞內的鈣超載及CAMKII酶的活性誘導了神經細胞的凋亡［10］。Chen S［11］等人通過對 Na＋－Ca2＋交換器的研究進一步證實了Ca2＋超載對心肌損傷的機制。近年來大量的動物實驗證實了CaM信號系統在腦損傷中起關鍵性作用。CaM可調控包括G1u、天門冬氨酸等興奮性氨基酸的釋放，尤其在腦缺血、缺氧后作用明顯［9～11］。有研究表明血清興奮性氨基酸水平與新生兒缺氧缺血性腦病的發生呈正相關［12］。通過培養糖尿病大鼠血管平滑肌細胞，Di Pietro等人研究發現，CaM直接參與NOS合成NO，高濃度的Ca2＋與CaM結合后激活CaMKⅡ從而增加iNOS的表達，導致糖尿病大鼠血管的損傷［13］。大量動物實驗證實，缺血再灌注后腦組織中的CaM水平隨著細胞內Ca2＋超載增加呈明顯上升趨勢［14］。綜上所述，我們可以看出目前大多數CAM方面的研究主要以IS的動物實驗模型為研究對象，而對于CAM與卒中嚴重程度的研究卻非常少。僅有一例臨床研究表明血清CaM值與急性IS有明顯相關性［15］。該研究發現急性IS后患者血清CAM水平明顯高與健康對照組，血清CAM水平與NIHSS評分呈正相關性。雖然這一研究已經肯定了CAM在卒中后病情嚴重程度的指導價值，但卒中發病后具體哪個時間段的CAM值最能反應腦卒中的嚴重程度，上述研究未進一步闡明。本文通過對卒中后48小時血清CaM值的進一步研究，探討CaM這一指標對腦血管病輕重程度的指導價值。在體內由于血清CAM水平的檢測具有快速、穩定等優點，故可將其作為評估病情嚴重程度的重要生物學指標。

本研究通過對CAM數值的觀察發現，卒中后48～72小時血清CAM濃度更能反映急性期病情的嚴重程度。依據入院12小時內以及6天后測量的CAM值對病情的評價作用是很小的。本研究表明急性腦缺血將引起早期的細胞內鈣超載，進而引發一些列由鈣信號系統介導的級聯反應。但這種級聯反應通常需要2小時左右的時間啟動。雖然啟動時間短暫，而由此引發的生物學效應卻可持續數天之久，激活其下游靶酶及有關轉錄調節因子，引起神經元損傷／抗損傷平衡的失調，導致細胞死亡。因此可以推斷卒中后級聯反應的強度與急性期病情的輕重是相關密切的，而這種反應的強弱將直接體現在患者腦組織損害的嚴重程度。因此，對血清CAM最佳測量時間段的確定是非常關鍵的因素，故本研究以卒中后48小時血清CaM值為研究指標。研究發現急性IS后患者血清CAM值明顯高于健康對照組，這一結論與以往的研究結果是一致的。大梗死組、小梗死組、腔隙性腦梗死組三組患者血清CAM值比較有顯著差異（F＝260．89，P ＜0．001），有 統 計 學 意 義。 進 一 步 經Pearson相關分析發現三組IS患者血清CAM水平與梗死面積呈正相關關系（r＝0．616，P＜0．05）。說明IS患者腦梗死面積越大，血清CAM水平就越高。

研究認為CAM水平的變化與患者腦損傷后鈣超載有關。進一步推測鈣超載會引起鈣調蛋白的過度表達，正是這種鈣調蛋白與離子過度的結合才導致卒中后腦損傷的發生。曾有人就多種鈣通道阻滯劑如三氟拉嗪、聯苯芐唑作了相關研究發現，其作用是通過抑制神經元細胞的Ca2＋內流而影響CaM的活性，進而抑制神經遞質的釋放、保護腦組織［16，17］。最近研究發現腦源性神經營養因子在腦梗死時合成增加，其神經保護機制可能與抑制鈣蛋白酶活性進而抑制Ca2＋的內流，防止腦內Ca2＋過度蓄積，進而起到了腦保護作用［18］。Tang LH［19］研究發現，磷酸肌酸是通過減少Ca2＋的內流進而減少自由基的產生，減少了腦細胞壞死。據Cheng等人研究發現電針可能是通過降低腦缺血再灌注大鼠腦神經元的CAM水平、抑制其下游信號轉導，減輕了腦細胞損傷［20］。因此抑制鈣調蛋白的功能可能是卒中治療的一個關鍵環節。

4 啟示與結論

目前，在缺血性腦卒中的治療中，尚未把CAM檢測作為評估缺血性事件輕重程度的常規指標，還未確定CAM相應的危險分層標準，本文研究結果提示，卒中后48小時血清鈣調蛋白水平可作為一重要指標評價急性缺血性腦卒中患者病情的嚴重程度。

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