miR－34在小鼠心臟組織中的表達和功能研究＊

陳錫峰，陳 飛，肖 波，2，黃安慶，

（1．蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇 蘇州215123；2．鹽城工學院環境科學與工程學院，江蘇 鹽城224051）

microRNA（miRNA）是一類約22個堿基組成的非編碼RNA，它主要與信使RNA（mRNA）的3′端非翻譯區結合，使基因“沉默”，達到調控下游基因的目的［1］。在細胞核內miRNA也是由RNA聚合酶Ⅱ從基因組起始轉錄的［2］，形成約300～1000bp左右的初始轉錄本，隨后經過Drosha酶的切割產生約100bp的miRNA前體［3］。此時由核孔運輸蛋白將前體miRNA運輸到細胞質中，再經過Dicer酶的切割成為一條約22個堿基對組成的雙鏈。這條雙鏈會被整合到RNA誘導的沉默復合物中（RISC），其中一條鏈會最終降解，另外一條指引沉默復合物到靶基因的mRNA 3′UTR中行使功能［4］。

心臟組織是機體重要器官，為機體承擔著輸送血液的重要功能。隨著年齡的增長，心臟細胞的纖維化程度會越來越高，心臟組織的供血能力和各項生理指標都會下降，同時各種心臟疾病的發生概率越來越大，如心肌梗死等。所以如何判斷心臟的年齡，如何對心臟疾病進行預警或者預防，都需要有一個快速而準確的檢測指標，這對臨床檢測具有重要意義。

哺乳動物miR－34基因經轉錄及切割后，最終形成 miR－34a、miR－34b、miR－34c三種成熟體 microRNA。有報道稱miR－34家族與腫瘤細胞因子p53通路有關，參與腫瘤、癌癥調控。并且在果蠅中的研究證明miR－34與果蠅壽命、神經元退化有關［5］。本研究旨在探討miR－34家族在小鼠心臟細胞中的作用及表達情況，以其作為心臟衰老的一個檢測指標。

1 材料和方法

1．1 材料 TRlzol試劑購自ambion公司，反轉錄試劑購 自 Vazyme公 司，qPCR SYBR GREEN 購自TaKaRa公司，DEPC水購自Sigma公司，瓊脂糖凝膠購自上海基因公司，PCR反應管購自Fisher公司，其它試劑均為國產分析純。C57BL／6小鼠購自斯萊克公司。

1．2 方法

1．2．1 RNA提取 采用TRlzol法提取總RNA。將組織研磨碎加入適量TRlzol（1mg組織／1ml Trizol溶液），然后室溫放置，加入1／5體積的氯仿并震蕩離心。此時試管中會分三層，用移液器小心將上層清液轉移到新試管中。隨后加入異丙醇，室溫放置10分鐘左右再離心。此時將會在試管底部看到白色沉淀，將異丙醇移除，加入70%的用DEPC水稀釋的酒精，離心后吸出酒精，將試管放置在通風廚中，將酒精盡量吹干，最后加入DEPC水溶解。

1．2．2 mRNA反轉成cDNA 按下列組分別依次加入試劑：RNA 2～4μg，oligo（dT），dNTP，DTT，RNA酶抑制劑，逆轉錄酶，37℃90分鐘。

1．2．3 miRNA的反轉 由于microRNA的特殊性，它的成熟體只有大約22個堿基，而且無ploy A尾，無法用普通的反轉方式將其反轉成cDNA。首先加入ploy A加尾酶，然后用特殊的比較長的下游引物和逆轉錄酶進行反轉（同mRNA反轉），保證microRNA反轉后的長度在100～200bp左右，使其可以被PCR檢測出來。RT－PCR反應程序：95℃2min、95℃30s、60℃30s、72℃30s、72℃8min；4℃保存。

1．2．4 實時熒光定量PCR 反應體系的配制：SYBR GREEN 10μl，正向引物和反向引物各0．4μl，cDNA模板2μl，用雙蒸水補齊到20μl。使用Roche公司的熒光定量PCR儀，熒光定量PCR擴增條件的設置：94℃30s、94℃20s、60℃20s，循環40次，60℃單點檢測信號。用相對定量的方式檢測基因表達量，即目的基因相對于管家基因的量為2－△△Ct。miR－34a的引物序列：正向 TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT，miR－34b的引物序列：正向AGGCAGTGTCATTAGCTGATTGT，miR－34c的引物序列：正向AGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGC。下游引物為試劑盒自帶引物，內參基因為 U6：正向CTCGCTTCGGCAGCACA，反向AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1．3 統計學處理 實驗數據采用SPSS軟件進行統計分析，用t檢驗分析實驗結果。P＜0．05表示有顯著性差異，P＜0．001時，表示有極顯著差異。

2 結果

2．1 總RNA質量檢測 提取組織總RNA后，取1～2μl經瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后可以清楚看到三條帶。最上面的兩條帶清晰而且比較亮，分別是28S、18SRNA，RNA基本沒有降解。紫外分光光度計檢測OD260／OD280也在1．8左右，說明RNA提取的質量很好，可以進行下游實驗，見圖1。

圖1 心臟總RNA檢測Figure 1 Detection of total RNA

2．2 檢測microRNA引物特異性 引物的特異性直接關系著后續實驗的可靠性。使用miRNA反轉的cDNA為模板，分別用miR－34家族的三種引物和通用下游引物檢測其特異性。在RT－PCR完成后，用3%的瓊脂糖凝膠檢測產物。miR－34a、miR－34b、miR－34c三個microRNA的反轉錄PCR產物都非常單一，說明引物特異性很好，見圖2。

圖2 引物特異性檢測Figure 2 Specificity of q－PCR primer

2．3 miR－34a表達量高于 miR－34b和 miR－34c 提取老年小鼠心肌細胞對miR－34家族進行定量檢測，發現在小鼠中miR－34a的表達量要顯著高于miR－34b、miR－34c。說明在心肌細胞中 miR－34a起著更為重要的作用，見圖3。

圖3 老年小鼠心臟組織中miR－34檢測分析Figure 3 Analysis of miR－34in old heart tissue

2．4 miR－34a在老年小鼠心臟中表達量顯著高于年輕小鼠 比較年輕小鼠（6周）和老年小鼠（12個月），我們發現miR－34a的表達量在老年小鼠心臟中表達量更高，具有顯著性差異。說明miR－34a可能是小鼠心臟功能衰老的一個重要標志，參與到與衰老有關的調節通路，見圖4。

2．5 miR－34b與miR－34c在年輕小鼠和老年小鼠中的表達也有差別，但沒有miR－34a明顯，表明與衰老關系不是特別緊密，見圖5。

3 討論

圖4 miR－34a在年輕小鼠和老年小鼠心臟中的表達Figure 4 Expression level of miR－34ain young and old heart

圖5 miR－34b與miR－34c在年輕小鼠和老年小鼠中的表達Figure 5 Expression level of miR－34band miR－34cin young and old heart

microRNAs是一類在轉錄后調控中發揮重要作用的非編碼RNA，小鼠體內約有30%的基因受非編碼RNA調控［6］。人類基因中有3%編碼有microRNAs［7］。部分microRNAs基因在染色體上位于兩個獨立基因之間，有的位于另一個基因的內含子中，有的甚至在其他基因的外顯子中。脊椎動物中microRNAs主要通過成熟體5′端的“種子序列”與靶基因的mRNA 3′UTR區域結合，降解mRNA或者抑制蛋白的翻譯，達到調控基因的目的［8，9］。也有研究表明，miRNA通過影響5′端帽子和3′端poly A尾來影響mRNA的穩定性［10］。很多具有重要功能的microRNAs在進化上是非常保守的，尤其是在“種子序列”的6到8個堿基。miR－34就是這樣一個家族，這個家族有三個成員：miR－34a、miR－34b和 miR－34c，先前的研究報道它參與p53調節通路，與腫瘤、癌癥的發生相關。果蠅中的研究發現miR－34家族有7種剪切形式，這主要是由Nbr酶介導的。在果蠅中敲除Nbr基因會減少miR－34家族的剪切種類，使其只有一種形式產生。這7種剪切形式中，它們的“種子序列”都是一樣的，只是3′端有個別堿基不同，其中有三種是主要表達的，這與小鼠中的miR－34家族是一致的。究發現miR－34主要在腦部表達，與果蠅的壽命以及運動爬升能力有關。果蠅 miR－34通過直接調節Eip74EF基因控制衰老過程［11］。

心臟組織是機體血液循環主要器官而心臟的衰老是機體衰老的重要標志，影響巨大。既然果蠅的miR－34可以調控機體衰老，那么對哺乳動物最重要的器官又是什么影響仍有待探索。本研究主要探討miR－34家族在心臟組織中的表達情況。由于 microRNAs的特殊性，通過加尾法反轉成cDNA，同時確認了三種不同引物的特異性。首先在小鼠心臟組織中分析了家族三個成員的表達趨勢，發現在這其中，miR－34a的表達量要顯著高于 miR－34b和 miR－34c，提示miR－34a的功能可能更重要些。為了證明在小鼠心臟中miR－34是否也和在果蠅中一致，具有調節衰老的作用，分別檢測了年輕小鼠和老年小鼠miR－34a的表達情況，發現miR－34a表達量在老年小鼠心臟中顯著高于年輕小鼠，約有2．5倍，而miR－34b在老年小鼠心臟中也有部分上調但是沒有miR－34a那么明顯，甚至miR－34c在老年小鼠中有部分下調，提示我們miR－34a在這個家族中與心臟衰老關系最緊密。

4 結論

miR－34a是miR－34家族的主要表達形式，同時在老年小鼠心臟中表達更高，可將miR－34a作為心臟衰老的標志，也可作為診斷心臟功能的重要指標。

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