卒中后抑郁大鼠小腦浦肯野細胞形態學改變及神經元凋亡情況研究

劉丹丹，隋汝波，張 磊，夏海苗，王春檢

卒中后抑郁 (post-stroke depression，PSD)是卒中后常見精神并發癥之一，可發生于卒中后的各個時期，嚴重影響患者的生活質量和愈后［1-3］。目前該病發病機制不明，多種機制并存。近年來越來越多的證據表明小腦與認知、行為及精神疾病相關［4-7］。同時，臨床試驗已證實電刺激小腦頂核能顯著改善PSD患者的抑郁癥狀［8］。小腦可通過廣泛的神經通路與其他部位腦組織發生聯系是不同精神疾病發生的病理基礎，目前國內外關于PSD小腦的研究多集中在影像學方面，本課題組之前的研究發現小腦低功能與PSD發病相關，于是本實驗在前期研究的基礎上觀察PSD大鼠小腦形態學改變，并觀察小腦浦肯野細胞凋亡情況，為明確PSD發病機制及PSD的臨床治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠72只，均經曠野實驗 (OFT)評分排除水平運動得分及垂直運動得分總和低于20分及超過120分的大鼠。體質量為250～350 g(由遼寧醫學院實驗動物中心提供)。許可證號:SCXK(遼)。實驗動物級別:普通級。

1.1.2 實驗試劑 兔抗大鼠激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(activated-caspase 3)抗體 (北京博奧森生物技術有限公司);鏈霉親和素-生物素復合物 (SABC)試劑盒及二氨基聯苯胺 (DAB)試劑盒 (北京中杉金橋生物技術有限公司);TUNEL試劑盒 (羅氏公司)。

1.1.3 主要儀器 LEICA-RM2135石蠟切片機，烘片機，烤片機，恒溫水浴箱，BH/CH20BIMF200顯微鏡，CTAS-1000細胞圖像分析儀。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實驗方法 將實驗大鼠適應飼養1周，晝夜節律光照，自由攝食進水，通風良好， (21±2)℃恒溫。將大鼠隨機分為4組:假手術組 (6只)給予假手術處理，除拴線不插入頸總動脈外，余同卒中組;抑郁組 (6只)給予慢性不可預見的溫和刺激(CUMS)結合孤養;余60只大鼠行大腦中動脈閉塞(MCAO)術，術后隨機取神經功能評分處于1～4分的大鼠12只，隨機分為卒中組 (6只)和PSD組 (6只)，PSD組大鼠于MCAO術后第3天給予CUMS結合孤養。

1.2.2 動物模型制備方法

1.2.2.1 大鼠 CUMS 模型 參照 Willner等［9］和 Katz等［10］方法:(1)禁食、禁水20 h;(2)禁水17 h;(3)傾斜鼠籠45℃17 h;(4)持續光照17 h;(5)濕籠(100 g鋸屑+200 ml水)21 h;(6)4℃游5 min;(7)水平搖晃5 min;(8)行為限制2 h;(9)夾尾1 min。9種刺激每天隨機采取1種，共刺激21 d。

1.2.2.2 大鼠MCAO模型［11］腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)將大鼠麻醉完全后，置于手術臺上，仰臥固定。取頸正中切口，分離、結扎左側頸總動脈近心端、頸外動脈及其分支動脈。夾閉頸內動脈遠端，通過距離頸總動脈分叉處近心端0.5 cm的切口插入經肝素處理過的魚線，當到達指定長度 (18 mm左右)時結扎頸內動脈并固定魚線。假手術組除不插入魚線外，其他過程同卒中組。青霉素局部外用后縫合皮膚。術中及術后注意大鼠的保溫，尤其是頭部的保溫。大鼠即刻出現右側Horner征被認為是模型成功的標志。

1.2.2.3 孤養 將抑郁組和PSD組動物單籠飼養。

1.3 觀察指標

1.3.1 行為學觀察和測試 CUMS開始第1、7、14、21天測量大鼠體質量，并行蔗糖水實驗 (禁食禁水20 h后測定大鼠1 h糖水消耗比例，即糖水消耗量/總液體消耗量×100%)和OFT(室內隔音，測定5 min水平和垂直運動得分)。

1.3.2 標本制備 各組大鼠完成行為學觀察和測試證明造模成功后，用4%多聚甲醛行局部灌流后分離出小腦組織，甲醛外固定，石蠟包埋，制備厚約5 μm的連續冠狀切片，制備防脫切片〔3-氨丙基三乙氧硅烷(APES)行防脫處理〕。

1.3.3 尼氏染色 (Nissl染色) 石蠟切片脫蠟至水化→置于1%甲苯胺藍中，50℃條件下染色20 min→雙蒸水漂洗→分色→梯度乙醇脫水→二甲苯透明→封片。觀察浦肯野細胞形態變化。

1.3.4 免疫組織化學染色 測定activated-caspase 3陽性細胞，按即用型免疫組織化學試劑盒說明書 (SABC法)操作。常規脫蠟至水，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉;Ⅰ抗:兔抗大鼠activated-caspase 3單克隆抗體 (1∶400);Ⅱ抗:生物素化山羊抗兔IgG;DAB顯色;常規蘇木素復染;脫水、透明、封片。用PBS代替Ⅰ抗進行免疫細胞化學染色，結果作為陰性對照。光鏡下觀察并計算陽性染色的浦肯野細胞數，即activated-caspase 3陽性細胞數。每張切片隨機取目標區域6個高倍鏡視野 (×400)，測量并記錄每個視野activated-caspase 3陽性細胞平均數。

1.3.5 TUNEL染色 采用TUNEL法標記凋亡細胞。切片常規脫蠟至水后，3%過氧化氫 (H2O2)室溫封閉后，蛋白酶K于37℃環境下消化10～15 min，標記液37℃標記2 h后封閉30 min，生物素化地高辛抗體37℃反應30 min，DAB顯色，蘇木素復染;脫水、透明、封片。不含末端脫氧核甘酸轉移酶 (TdT)反應液的為陰性對照。每張玻片分別隨機取6個高倍鏡視野，計數陽性細胞數和細胞總數，計算浦肯野細胞凋亡率，凋亡率 (%)=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行分析。計量資料以 ()表示，符合正態分布的多組間均數比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)。檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 行為學觀察 4組大鼠應激 (CUMS)后第1天體質量、糖水消耗比例、水平運動、垂直運動比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05);而應激后第7(除外體質量和水平運動)、14、21天4組大鼠上述指標比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05)。組間兩兩比較:應激后第14、21天卒中組、抑郁組、PSD組體質量和水平運動低于假手術組，應激后第14、21天抑郁組和PSD組體質量、水平運動低于卒中組;應激后第7、14、21天，卒中組、抑郁組、PSD組糖水消耗比例低于假手術組，應激后第14、21天抑郁組、PSD組糖水消耗比例低于卒中組;應激后第7天卒中組、PSD組垂直運動低于假手術組，應激后第14、21天卒中組、抑郁組、PSD組垂直運動低于假手術組，應激后第14天PSD組垂直運動低于卒中組，應激后第21天抑郁組、PSD組垂直運動低于卒中組，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表1～4)。

表1 應激后不同時間各組大鼠體質量比較 (，g)Table 1 Comparison of weight of rats among different groups at different time points after stimulation

表1 應激后不同時間各組大鼠體質量比較 (，g)Table 1 Comparison of weight of rats among different groups at different time points after stimulation

注:與假手術組比較，△P＜0.01;與卒中組比較，▲P＜0.05，☆P＜0.01

組別 只數 第1天 第7天 第14天 第21天假手術組 6 231.9 ± 7.1 237.4 ±12.0 290.9 ±5.0 322.7 ± 5.1卒中組 6 235.8 ± 9.5 229.0 ± 5.2 271.0 ±7.8△ 280.2 ± 7.0△抑郁組 6 237.8 ± 5.4 230.9 ± 7.1 258.4 ±3.8△☆ 268.7 ±10.6△▲PSD 組 6 230.1 ±11.4 226.3 ± 5.0 233.9 ±6.0△☆ 232.4 ± 8.1△☆F 0.990 2.179 100.246 131.809 P值值0.417 0.122 0.000 0.000

表2 應激后不同時間各組大鼠糖水消耗比例比較 (，%)Table 2 Comparison of sugar consumption rate of rats among different groups at different time points after stimulation

表2 應激后不同時間各組大鼠糖水消耗比例比較 (，%)Table 2 Comparison of sugar consumption rate of rats among different groups at different time points after stimulation

注:與假手術組比較，△P＜0.01;與卒中組比較，▲P＜0.05，☆P＜0.01

組別 只數 第1天 第7天 第14天 第21天假手術組 6 81.6 ±7.4 78.8 ±3.7 81.3 ±2.8 85.0 ±8.7卒中組 6 80.3 ±6.0 60.4 ±4.5△ 63.7 ±3.2△ 60.4 ±3.9△抑郁組 6 77.7 ±5.8 63.0 ±4.3△ 58.2 ±5.2△▲ 44.6 ±8.4△☆PSD 組 6 81.7 ±6.1 59.4 ±3.1△ 39.2 ±2.6△☆ 25.4 ±4.1△☆F 值0.665 0.000 0.000 0.000 0.532 31.880 138.043 86.571 P值

表3 應激后不同時間點各組大鼠水平運動比較 (，次/5 min)Table 3 Comparison of horizontal motion of rats among different groups at different time points after stimulation

表3 應激后不同時間點各組大鼠水平運動比較 (，次/5 min)Table 3 Comparison of horizontal motion of rats among different groups at different time points after stimulation

注:與假手術組比較，△P＜0.01;與卒中組比較，☆P＜0.01

組別 只數 第1天 第7天 第14天 第21天假手術組 6 64.6 ±14.1 61.9 ±12.2 61.0 ±5.2 62.9 ±3.1卒中組 6 60.1 ±14.2 52.0 ± 2.8 50.0 ±3.2△ 46.6 ±2.1△抑郁組 6 64.5 ± 9.5 50.3 ±14.5 43.9 ±1.6△☆ 36.5 ±1.1△☆PSD 組 6 61.6 ±13.3 46.8 ± 4.6 38.7 ±3.6△☆ 31.1 ±1.6△☆F 0.179 3.117 42.461 182.313 P值值0.909 0.076 0.000 0.000

表4 應激后不同時間各組大鼠垂直運動比較 (，次/5 min)Table 4 Comparison of vertical motion of rats among different groups at different time points after stimulation

表4 應激后不同時間各組大鼠垂直運動比較 (，次/5 min)Table 4 Comparison of vertical motion of rats among different groups at different time points after stimulation

注:與假手術組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與卒中組比較，▲P＜0.05，☆P ＜0.01

組別 只數 第1天 第7天 第14天 第21天假手術組 6 19.4 ±6.1 21.3 ±3.4 23.0 ±2.7 24.2 ±4.7卒中組 6 14.7 ±3.2 12.6 ±3.6△ 18.4 ±0.9* 17.8 ±6.5*抑郁組 6 19.6 ±5.3 15.9 ±3.3 16.0 ±4.7△ 11.0 ±3.4△▲PSD 組 6 19.8 ±4.5 8.8 ±8.6△ 7.4 ±4.0△☆ 5.1 ±2.0△☆F 值0.234 0.004 0.000 0.000 1.542 6.126 22.142 20.566 P值

2.2 尼氏染色結果 假手術組尼氏體在尼氏染色中清晰可辨，受染后呈塊狀，尼氏體大而數量多，反映神經元合成蛋白質的功能較強 (見圖1A)。與假手術組比較，卒中組 (見圖1B)、抑郁組 (見圖1C)及PSD組(見圖1D)均有尼氏體減少甚至消失，表現為尼氏體從核周開始崩解為細塵狀顆粒，并逐漸向外擴展，進而完全溶解消失，細胞質著色淺，胞體腫脹。

2.3 免疫組織化學結果 大鼠小腦浦肯野細胞activated-caspase 3抗原的表達:小腦浦肯野細胞單層排列，呈梨形或燒瓶形，陽性染色細胞呈棕黃色，位于細胞質。假手術組activated-caspase 3陽性表達不明顯。各組大鼠小腦浦肯野細胞activated-caspase 3陽性細胞數比較，差異有統計學意義 (P＜0.05);其中卒中組、抑郁組、PSD組高于假手術組，抑郁組、PSD組又高于卒中組，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表5、圖2)。

2.4 TUNEL染色結果 光鏡下凋亡神經元胞核深染為棕黃色，胞體縮小，可見核固縮和核破裂，非凋亡神經元胞核則呈藍色。假手術組小腦浦肯野細胞偶可見細胞凋亡，推測是生理性死亡。各組大鼠小腦浦肯野細胞凋亡率比較，差異有統計學意義 (P＜0.05);其中卒中組、抑郁組、PSD組高于假手術組，抑郁組、PSD組又高于卒中組，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表5、圖3)。

3 討論

愈來愈多的研究表明，精神分裂癥、抑郁等精神紊亂與小腦病變有關，而小腦急性和慢性病變均可引起小腦認知情感障礙綜合征［12-14］，且小腦低功能的程度與抑郁的嚴重程度呈正相關。既然結構決定功能，故推測PSD作為一種特殊抑郁，其發病時小腦存在結構性的病理改變，且這種病理改變與PSD發病相關。

本實驗通過建立MCAO模型，模擬與PSD發病相關的“內源性機制學說”。待卒中急性期過后，加以CUMS和孤養模擬人類PSD發病機制中的社會應激因素。發現隨著刺激時間的延長，PSD組大鼠體質量、糖水消耗比例 (心境低落，食欲下降)、水平運動及垂直運動 (活動減少，興趣下降)下降，從剛開始刺激后低于假手術組到后來低于卒中組，說明大鼠整體精神不振，焦慮，毛色晦暗無光澤，進食減少，活動減少，不動時間延長，出現抑郁的核心癥狀——情緒低落、興趣缺乏和樂趣缺乏。行為學觀察和測試結果證實成功建立PSD模型。

圖1 各組大鼠小腦浦肯野細胞中尼氏小體的表達 (Nissl雜色，×400)Figure 1 Expression of Nissl bodies in cerebellar Purkinje cells in each group

圖2 各組大鼠小腦浦肯野細胞中activated-caspase 3的表達 (SABC法，×400)Figure 2 Expression of activated-caspase 3 in cerebellar Purkinje cells in each group

圖3 各組大鼠小腦浦肯野細胞凋亡情況 (TUNEL雜色，×400)Figure 3 The apoptotic changes in cerebellar Purkinje cells in each group

細胞凋亡是細胞受到傷害后為維持內環境穩定而發生的一種程序性細胞死亡。在中樞神經系統中，海馬、紋狀體、大腦和小腦皮質對缺血較敏感，缺血后易發生遲發性神經元的損傷，而在小腦皮質各神經元中尤以蒲肯野細胞最為敏感［15］。近期國內研究發現PSD大鼠海馬和杏仁核區域凋亡細胞增加［16-17］，而關于小腦區域是否存在神經元的凋亡壞死還不明了。腦缺血后細胞主要通過死亡受體途徑［18-19］、線粒體途徑［20-21］及內質網應激［22］途徑發生凋亡壞死。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)是半胱氨酸蛋白酶家族的重要成員，屬于凋亡執行蛋白類，多種凋亡相關蛋白級聯反應通過caspase 3引發細胞凋亡。本實驗發現，與假手術組、卒中組比較，PSD組大鼠小腦浦肯野細胞胞體腫脹，尼氏小體數量減少，細胞質著色淺，反映蛋白質合成功能下降;凋亡相關蛋白actived-caspase 3陽性細胞數和小腦浦肯野細胞凋亡率增加。以上結果提示PSD大鼠小腦浦肯野細胞凋亡增加，且這種改變與半胱氨酸蛋白酶依賴的凋亡途徑相關。

表5 各組大鼠浦肯野細胞activated-caspase 3陽性細胞數及凋亡率比較()Table 5 Comparison of activated-caspase 3 positive cells and apoptosis rate of cerebellar Purkinje cells in each group

表5 各組大鼠浦肯野細胞activated-caspase 3陽性細胞數及凋亡率比較()Table 5 Comparison of activated-caspase 3 positive cells and apoptosis rate of cerebellar Purkinje cells in each group

注:與假手術組比較，*P＜0.01;與卒中組比較，△P＜0.01

組別 只數 activated-caspase 3陽性細胞數 凋亡率(%)假手術組 6 0.7 ±0.3 3.9 ±0.3卒中組 6 4.5 ±0.8* 22.9 ±1.6*抑郁組 6 6.0±1.0＊△ 27.4±1.8＊△PSD 組 6 7.3 ±0.9＊△ 38.9±4.7＊△F 值0.000 0.000 71.762 181.219 P值

小腦皮質可以參與感覺和運動信息的加工處理。蒲肯野細胞是小腦皮質發出的惟一能夠傳出沖動的神經元，其軸突止于小腦的深部核團 (齒狀核和頂核)，接受傳入小腦的全部沖動。現已證實浦肯野細胞能通過釋放γ-氨基丁酸 (GABA)抑制小腦深部核團的活動［23］。PSD大鼠小腦浦肯野細胞在發生凋亡壞死后對深部核團的抑制作用減弱，可反射性地引起炎性細胞因子網絡失衡，這與學者提出的PSD發病的細胞因子假說相符［24］。本課題組前期實驗結果提示電刺激小腦頂核細胞能改善浦肯野細胞超微結構的損傷，Sui等［25］在總結前人工作的基礎上提出小腦低功能可能參與PSD發病的假說，以上均提示小腦損傷與PSD發病相關。

綜上所述，本實驗發現PSD大鼠小腦形態學發生改變，小腦浦肯野細胞凋亡增加，且這種改變與PSD發病相關，為明確PSD的發病機制提供了基礎。

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