高效液相色譜—電霧式檢測器同時測定豬、牛、羊、熊膽粉中5種膽汁酸的含量

潘媛媛等

摘要：建立了高效液相色譜電霧式檢測器（HPLCCAD）同時測定豬、熊、牛、羊膽粉中5種膽汁酸的檢測方法，優化了色譜條件，采用冰醋酸乙腈水（0.1∶30∶70， V/V）與乙腈梯度洗脫，使用Waters HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35.0 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量10 μL。本方法對5種膽汁酸的定量限均為30 ng，檢出限均為6 ng，線性范圍均為0.6～300 mg/L，相關系數為0.9988～0.9994，加標回收率（n=6）為85.0%～97.1%，各膽粉樣品經堿加熱水解后測定各膽汁酸的含量，結果與文獻報道一致。將本方法與高效液相色譜蒸發光散射檢測器（HPLCELSD）法相比較，結果顯示，CAD的靈敏度為ELSD的3.0倍，線性范圍比ELSD高2個數量級，并且CAD的響應因子比ELSD更具有一致性。

關鍵詞：高效液相色譜； 電霧式檢測器； 蒸發光散射檢測器； 膽粉； 膽汁酸

1引言

膽汁酸（Bile acid）是脂肪代謝的必需物質，常見的具有藥物活性的膽汁酸有膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸，其中，熊去氧膽酸為熊膽所特有，并且被認為是這些膽汁酸中最有效的活性成分[1，2]，而豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸等均為替代品或人工合成熊去氧膽酸的原料[3]，因此，鑒別膽粉種屬來源和測定各種膽汁酸含量十分必要[4]。目前，使用反相高效液相色譜法（RPHPLC）可以實現這些膽汁酸的定性和定量分析[5]。但由于膽汁酸是一類紫外吸收較弱的固醇類化合物，使用紫外檢測器（UV）檢測靈敏度很低[6]，目前大多采用蒸發光散射檢測器（ELSD）檢測[7]。

電霧式檢測器（Charged Aerosol Detector，CAD）是一種通用型檢測器[8]，對不同結構的化合物有統一的響應，已經被應用于檢測脂類[9]、皂苷類[10]等弱紫外吸收的物質。本文使用HPLCCAD同時測定熊、豬、牛、羊膽粉中5種膽汁酸的含量，結果顯示，本方法可用于測定各種膽汁酸的含量及鑒別膽粉的種屬來源。將本方法與高效液相色譜蒸發光散射檢測器（HPLCELSD）法相比較，CAD的靈敏度為ELSD的3.0倍，線性范圍比ELSD高2個數量級，并且CAD的響應因子比ELSD更具有一致性。

2實驗部分

2.1儀器和試劑

Ultimate 3000液相色譜（美國賽默飛世爾科技公司）配備Corona Ultra電霧式檢測器及Chromeleon 7.1色譜工作站，Waters Acquity UPLC（美國沃特世公司）配備Acquity ELSD檢測器及Empower 2.0色譜工作站，XS205D型分析天平（德國梅特勒托利多公司），DGG9023A型電熱恒溫箱（上海森信實驗儀器有限公司）。膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸標準品、牛膽粉、羊膽粉、熊膽粉、豬膽粉（中國食品藥品檢定研究院）； 乙腈（色譜純，美國Honeywell公司）， 冰醋酸、NaOH、HCl（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

2.2標準溶液的配制

2.3樣品前處理

3結果與討論

3.1色譜條件優化

膽汁酸的極性較大，選擇對極性化合物具有較強保留的Waters HSS T3色譜柱，使用梯度洗脫方式可以實現5種膽汁酸完全分離，且該色譜柱的柱流失較低，可以降低基線噪音，適用于通用型檢測器ELSD和CAD（見圖1）。膽汁酸為酸性化合物，使用0.1%冰醋酸作流動相可抑制膽汁酸電離，使其在反相色譜柱中獲得更好的保留效果。該色譜條件與質譜兼容，對于復雜樣品也可直接轉移至質譜分析[12]。

摘要：建立了高效液相色譜電霧式檢測器（HPLCCAD）同時測定豬、熊、牛、羊膽粉中5種膽汁酸的檢測方法，優化了色譜條件，采用冰醋酸乙腈水（0.1∶30∶70， V/V）與乙腈梯度洗脫，使用Waters HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35.0 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量10 μL。本方法對5種膽汁酸的定量限均為30 ng，檢出限均為6 ng，線性范圍均為0.6～300 mg/L，相關系數為0.9988～0.9994，加標回收率（n=6）為85.0%～97.1%，各膽粉樣品經堿加熱水解后測定各膽汁酸的含量，結果與文獻報道一致。將本方法與高效液相色譜蒸發光散射檢測器（HPLCELSD）法相比較，結果顯示，CAD的靈敏度為ELSD的3.0倍，線性范圍比ELSD高2個數量級，并且CAD的響應因子比ELSD更具有一致性。

關鍵詞：高效液相色譜； 電霧式檢測器； 蒸發光散射檢測器； 膽粉； 膽汁酸

1引言

膽汁酸（Bile acid）是脂肪代謝的必需物質，常見的具有藥物活性的膽汁酸有膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸，其中，熊去氧膽酸為熊膽所特有，并且被認為是這些膽汁酸中最有效的活性成分[1，2]，而豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸等均為替代品或人工合成熊去氧膽酸的原料[3]，因此，鑒別膽粉種屬來源和測定各種膽汁酸含量十分必要[4]。目前，使用反相高效液相色譜法（RPHPLC）可以實現這些膽汁酸的定性和定量分析[5]。但由于膽汁酸是一類紫外吸收較弱的固醇類化合物，使用紫外檢測器（UV）檢測靈敏度很低[6]，目前大多采用蒸發光散射檢測器（ELSD）檢測[7]。

電霧式檢測器（Charged Aerosol Detector，CAD）是一種通用型檢測器[8]，對不同結構的化合物有統一的響應，已經被應用于檢測脂類[9]、皂苷類[10]等弱紫外吸收的物質。本文使用HPLCCAD同時測定熊、豬、牛、羊膽粉中5種膽汁酸的含量，結果顯示，本方法可用于測定各種膽汁酸的含量及鑒別膽粉的種屬來源。將本方法與高效液相色譜蒸發光散射檢測器（HPLCELSD）法相比較，CAD的靈敏度為ELSD的3.0倍，線性范圍比ELSD高2個數量級，并且CAD的響應因子比ELSD更具有一致性。

2實驗部分

2.1儀器和試劑

Ultimate 3000液相色譜（美國賽默飛世爾科技公司）配備Corona Ultra電霧式檢測器及Chromeleon 7.1色譜工作站，Waters Acquity UPLC（美國沃特世公司）配備Acquity ELSD檢測器及Empower 2.0色譜工作站，XS205D型分析天平（德國梅特勒托利多公司），DGG9023A型電熱恒溫箱（上海森信實驗儀器有限公司）。膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸標準品、牛膽粉、羊膽粉、熊膽粉、豬膽粉（中國食品藥品檢定研究院）； 乙腈（色譜純，美國Honeywell公司）， 冰醋酸、NaOH、HCl（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

2.2標準溶液的配制

2.3樣品前處理

3結果與討論

3.1色譜條件優化

膽汁酸的極性較大，選擇對極性化合物具有較強保留的Waters HSS T3色譜柱，使用梯度洗脫方式可以實現5種膽汁酸完全分離，且該色譜柱的柱流失較低，可以降低基線噪音，適用于通用型檢測器ELSD和CAD（見圖1）。膽汁酸為酸性化合物，使用0.1%冰醋酸作流動相可抑制膽汁酸電離，使其在反相色譜柱中獲得更好的保留效果。該色譜條件與質譜兼容，對于復雜樣品也可直接轉移至質譜分析[12]。

摘要：建立了高效液相色譜電霧式檢測器（HPLCCAD）同時測定豬、熊、牛、羊膽粉中5種膽汁酸的檢測方法，優化了色譜條件，采用冰醋酸乙腈水（0.1∶30∶70， V/V）與乙腈梯度洗脫，使用Waters HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35.0 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量10 μL。本方法對5種膽汁酸的定量限均為30 ng，檢出限均為6 ng，線性范圍均為0.6～300 mg/L，相關系數為0.9988～0.9994，加標回收率（n=6）為85.0%～97.1%，各膽粉樣品經堿加熱水解后測定各膽汁酸的含量，結果與文獻報道一致。將本方法與高效液相色譜蒸發光散射檢測器（HPLCELSD）法相比較，結果顯示，CAD的靈敏度為ELSD的3.0倍，線性范圍比ELSD高2個數量級，并且CAD的響應因子比ELSD更具有一致性。

關鍵詞：高效液相色譜； 電霧式檢測器； 蒸發光散射檢測器； 膽粉； 膽汁酸

1引言

膽汁酸（Bile acid）是脂肪代謝的必需物質，常見的具有藥物活性的膽汁酸有膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸，其中，熊去氧膽酸為熊膽所特有，并且被認為是這些膽汁酸中最有效的活性成分[1，2]，而豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸等均為替代品或人工合成熊去氧膽酸的原料[3]，因此，鑒別膽粉種屬來源和測定各種膽汁酸含量十分必要[4]。目前，使用反相高效液相色譜法（RPHPLC）可以實現這些膽汁酸的定性和定量分析[5]。但由于膽汁酸是一類紫外吸收較弱的固醇類化合物，使用紫外檢測器（UV）檢測靈敏度很低[6]，目前大多采用蒸發光散射檢測器（ELSD）檢測[7]。

電霧式檢測器（Charged Aerosol Detector，CAD）是一種通用型檢測器[8]，對不同結構的化合物有統一的響應，已經被應用于檢測脂類[9]、皂苷類[10]等弱紫外吸收的物質。本文使用HPLCCAD同時測定熊、豬、牛、羊膽粉中5種膽汁酸的含量，結果顯示，本方法可用于測定各種膽汁酸的含量及鑒別膽粉的種屬來源。將本方法與高效液相色譜蒸發光散射檢測器（HPLCELSD）法相比較，CAD的靈敏度為ELSD的3.0倍，線性范圍比ELSD高2個數量級，并且CAD的響應因子比ELSD更具有一致性。

2實驗部分

2.1儀器和試劑

Ultimate 3000液相色譜（美國賽默飛世爾科技公司）配備Corona Ultra電霧式檢測器及Chromeleon 7.1色譜工作站，Waters Acquity UPLC（美國沃特世公司）配備Acquity ELSD檢測器及Empower 2.0色譜工作站，XS205D型分析天平（德國梅特勒托利多公司），DGG9023A型電熱恒溫箱（上海森信實驗儀器有限公司）。膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸標準品、牛膽粉、羊膽粉、熊膽粉、豬膽粉（中國食品藥品檢定研究院）； 乙腈（色譜純，美國Honeywell公司）， 冰醋酸、NaOH、HCl（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

2.2標準溶液的配制

2.3樣品前處理

3結果與討論

3.1色譜條件優化

膽汁酸的極性較大，選擇對極性化合物具有較強保留的Waters HSS T3色譜柱，使用梯度洗脫方式可以實現5種膽汁酸完全分離，且該色譜柱的柱流失較低，可以降低基線噪音，適用于通用型檢測器ELSD和CAD（見圖1）。膽汁酸為酸性化合物，使用0.1%冰醋酸作流動相可抑制膽汁酸電離，使其在反相色譜柱中獲得更好的保留效果。該色譜條件與質譜兼容，對于復雜樣品也可直接轉移至質譜分析[12]。