基于流式微球分析技術(shù)的超高靈敏度蛋白激酶活性分析

蛋白激酶引發(fā)的蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用。研究表明，眾多的人類(lèi)疾病和蛋白激酶的活性異常密切相關(guān)，蛋白激酶也因而成為治療癌癥、炎癥和其它免疫調(diào)控紊亂等復(fù)雜性疾病的重要藥物靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)、篩選小分子蛋白激酶活性抑制劑是當(dāng)前新藥研發(fā)的重要方向。因此，建立操作簡(jiǎn)單、成本低廉、靈敏度高的蛋白激酶活性檢測(cè)方法是實(shí)現(xiàn)以蛋白激酶為靶點(diǎn)進(jìn)行疾病診斷及新藥開(kāi)發(fā)的先決條件。傳統(tǒng)激酶活性分析方法主要是依賴(lài)放射性32P標(biāo)記或?qū)μ囟姿峄被嵛稽c(diǎn)具有特異性識(shí)別作用的親和抗體來(lái)區(qū)分底物肽/蛋白是否被磷酸化。這兩類(lèi)方法都存在自身固有缺陷，如放射性標(biāo)記會(huì)對(duì)人體以及環(huán)境產(chǎn)生危害，而磷酸化親和抗體則受到制備復(fù)雜、成本高、操作繁瑣等因素制約，因此開(kāi)發(fā)非放射性、無(wú)需采用識(shí)別抗體的蛋白激酶活性分析方法仍是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

最近，陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院劉成輝研究組提出了一種新穎的基于流式微球分析技術(shù)的蛋白激酶活性分析方法，以極為簡(jiǎn)單的操作實(shí)現(xiàn)了蛋白激酶A（PKA）的超高靈敏度檢測(cè)，相關(guān)成果發(fā)表在Anal. Chem.， 2013， DOI： 10.1021/ac4024457。該研究組首先對(duì)多孔SiO2微球進(jìn)行了化學(xué)修飾，使其表面包覆一層Zr4+離子層，而Zr4+能夠特異性識(shí)別并捕獲磷酸化多肽，從而克服了常規(guī)方法對(duì)放射性標(biāo)記或親和抗體的依賴(lài)。在磷酸化反應(yīng)體系中，如果存在蛋白激酶（以PKA為例），則熒光素標(biāo)記的底物肽將被磷酸化從而可被Zr4+修飾的SiO2微球識(shí)別并捕獲到微球表面，而未磷酸化的熒光多肽不會(huì)與微球作用，因此，體系中激酶的活性越高，則微球表面富集的磷酸化多肽越多，微球的熒光信號(hào)越強(qiáng)，該研究創(chuàng)新性采用流式細(xì)胞儀實(shí)現(xiàn)了微球熒光信號(hào)的靈敏、快速分析。

由于Zr4+修飾的SiO2多孔微球比表面積大，可在微球表面快速、高選擇性、高密度地富集磷酸化熒光底物肽，使熒光信號(hào)高度集中；同時(shí)，流式細(xì)胞儀兼具散射、熒光等多信號(hào)參數(shù)同時(shí)輸出功能，可自動(dòng)區(qū)分微球熒光信號(hào)與溶液中游離的熒光信號(hào)，因此該方法無(wú)需將微球與未磷酸化的游離熒光肽進(jìn)行分離，將蛋白激酶磷酸化反應(yīng)體系與Zr4+修飾的SiO2微球混合后即可直接進(jìn)行流式分析，因此該方法在保證了高靈敏度的同時(shí)，極大地簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟。隨著小型便攜式流式檢測(cè)儀的逐步推廣以及多孔板高通量進(jìn)樣模式在流式分析技術(shù)中的逐漸成熟，該方法在以蛋白激酶為靶點(diǎn)的疾病診斷及藥物篩選領(lǐng)域展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。