液相色譜法測定抗體與對硫磷、異丙威及其競爭原的吸附常數(shù)

王鳴華等

摘要：為建立一種測定抗體與小分子化合物吸附性能的色譜分析方法，本研究設計合成了5種對硫磷半抗原和2種異丙威半抗原，將半抗原P1和A1與同一載體蛋白偶聯(lián)制備“多簇”免疫抗原，免疫動物獲得相應的多克隆抗體；采用高效液相色譜結合固相吸附的方法，測定了抗體與對硫磷、異丙威及其競爭原的吸附性能，并通過吸附動力學模型擬合抗體與化合物的吸附行為，獲得相應的吸附常數(shù)。結果表明抗體與小分子化合物的吸附動力學符合Freundilich模型，抗體與不同化合物的吸附常數(shù)為：對硫磷>P1>P4>P3>P2>P5，大小順序與ELISA親和常數(shù)的測定結果相符，與ELISA靈敏度測定結果有很好的相關性。

關鍵詞：液相色譜； 對硫磷； 異丙威； 競爭原； 抗體； 吸附常數(shù)

1引言

基于抗原抗體分子識別的免疫分析技術，特別是酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA）以特異、靈敏、簡便、快速的特點，在農藥殘留檢測中具有獨特優(yōu)勢[1]。半抗原、人工抗原、抗體及標記物是小分子免疫分析中的4個基本要素，抗體是核心試劑，而抗體的親和力（Affinity）是確定抗體性質的重要參數(shù)之一，是指抗體與抗原結合的緊密程度，多以親和常數(shù)（Affinity constant）表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非競爭ELISA法測定抗體的親和常數(shù)，該法不受抗原分子量大小的限制，操作簡便易行，結果可靠。但該方法只能測定抗體與包被抗原的親和力，而不能測定抗體與待測小分子化合物的親和力。

在競爭ELISA分析方法中，往往異源分析的靈敏度明顯高于同源分析[4]，即當抗體與待測化合物的親和力不變時，抗體與包被抗原的親和力越弱，待測化合物的競爭能力越強，方法靈敏度就越高。因此，抗體與包被抗原的親和力強弱不能指導方法建立中包被抗原的篩選，只能合成多種包被抗原后，通過免疫分析結果的評價篩選最佳的包被抗原[5]或利用分子模擬技術對抗體和半抗原進行模擬分析[6]，選擇合適的異源半抗原（競爭原）。而這些方法存在一定的盲目性或需要昂貴的設備和專業(yè)技術人員。因而，建立一種簡便、可靠的能直接比較抗體與競爭原和待測物親和力強弱的方法，可減少免疫分析中競爭原篩選的盲目性和工作量。

在ELISA測定中，抗體與競爭原的吸附屬于固液吸附，而固體液體界面的吸附過程可用Langmiur或Freundilich吸附動力學模型描述，獲得的吸附常數(shù)可用于表示主體和客體間的親和力大小[7]。有關利用吸附常數(shù)描述抗體與競爭原或待測物親和力大小的文章尚未見報道。本研究以抗對硫磷和異丙威抗體為例，采用高效液相色譜結合固相吸附的方法，測定“寬譜”抗體對對硫磷、異丙威及其半抗原的吸附能力，通過吸附常數(shù)的比較，判斷抗體的特性及競爭原的優(yōu)劣，并與ELISA分析結果相比較，驗證了方法的可行性。2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；iMARKTM酶標儀（美國BioRad公司）；DU 800核酸蛋白儀（美國Beckman公司）；Wellwash Plus洗板機（美國Thermo公司）；96孔聚乙烯酶標板（加拿大Jet Biochemical公司）；移液槍（美國Eppendorf 公司）。

對硫磷，異丙威標準品（國家標準物質研究中心）；牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二抗（羊抗兔）（SIGMA公司）；碳酸鹽緩沖液（CBS，0.05 mol/L，pH 9.6），磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.4）；PBST等緩沖液（實驗室配制）；甲醇（色譜純，美國天地公司）；其它試劑均為分析純。

2.2半抗原合成

摘要：為建立一種測定抗體與小分子化合物吸附性能的色譜分析方法，本研究設計合成了5種對硫磷半抗原和2種異丙威半抗原，將半抗原P1和A1與同一載體蛋白偶聯(lián)制備“多簇”免疫抗原，免疫動物獲得相應的多克隆抗體；采用高效液相色譜結合固相吸附的方法，測定了抗體與對硫磷、異丙威及其競爭原的吸附性能，并通過吸附動力學模型擬合抗體與化合物的吸附行為，獲得相應的吸附常數(shù)。結果表明抗體與小分子化合物的吸附動力學符合Freundilich模型，抗體與不同化合物的吸附常數(shù)為：對硫磷>P1>P4>P3>P2>P5，大小順序與ELISA親和常數(shù)的測定結果相符，與ELISA靈敏度測定結果有很好的相關性。

關鍵詞：液相色譜； 對硫磷； 異丙威； 競爭原； 抗體； 吸附常數(shù)

1引言

基于抗原抗體分子識別的免疫分析技術，特別是酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA）以特異、靈敏、簡便、快速的特點，在農藥殘留檢測中具有獨特優(yōu)勢[1]。半抗原、人工抗原、抗體及標記物是小分子免疫分析中的4個基本要素，抗體是核心試劑，而抗體的親和力（Affinity）是確定抗體性質的重要參數(shù)之一，是指抗體與抗原結合的緊密程度，多以親和常數(shù)（Affinity constant）表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非競爭ELISA法測定抗體的親和常數(shù)，該法不受抗原分子量大小的限制，操作簡便易行，結果可靠。但該方法只能測定抗體與包被抗原的親和力，而不能測定抗體與待測小分子化合物的親和力。

在競爭ELISA分析方法中，往往異源分析的靈敏度明顯高于同源分析[4]，即當抗體與待測化合物的親和力不變時，抗體與包被抗原的親和力越弱，待測化合物的競爭能力越強，方法靈敏度就越高。因此，抗體與包被抗原的親和力強弱不能指導方法建立中包被抗原的篩選，只能合成多種包被抗原后，通過免疫分析結果的評價篩選最佳的包被抗原[5]或利用分子模擬技術對抗體和半抗原進行模擬分析[6]，選擇合適的異源半抗原（競爭原）。而這些方法存在一定的盲目性或需要昂貴的設備和專業(yè)技術人員。因而，建立一種簡便、可靠的能直接比較抗體與競爭原和待測物親和力強弱的方法，可減少免疫分析中競爭原篩選的盲目性和工作量。

在ELISA測定中，抗體與競爭原的吸附屬于固液吸附，而固體液體界面的吸附過程可用Langmiur或Freundilich吸附動力學模型描述，獲得的吸附常數(shù)可用于表示主體和客體間的親和力大小[7]。有關利用吸附常數(shù)描述抗體與競爭原或待測物親和力大小的文章尚未見報道。本研究以抗對硫磷和異丙威抗體為例，采用高效液相色譜結合固相吸附的方法，測定“寬譜”抗體對對硫磷、異丙威及其半抗原的吸附能力，通過吸附常數(shù)的比較，判斷抗體的特性及競爭原的優(yōu)劣，并與ELISA分析結果相比較，驗證了方法的可行性。2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；iMARKTM酶標儀（美國BioRad公司）；DU 800核酸蛋白儀（美國Beckman公司）；Wellwash Plus洗板機（美國Thermo公司）；96孔聚乙烯酶標板（加拿大Jet Biochemical公司）；移液槍（美國Eppendorf 公司）。

對硫磷，異丙威標準品（國家標準物質研究中心）；牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二抗（羊抗兔）（SIGMA公司）；碳酸鹽緩沖液（CBS，0.05 mol/L，pH 9.6），磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.4）；PBST等緩沖液（實驗室配制）；甲醇（色譜純，美國天地公司）；其它試劑均為分析純。

2.2半抗原合成

摘要：為建立一種測定抗體與小分子化合物吸附性能的色譜分析方法，本研究設計合成了5種對硫磷半抗原和2種異丙威半抗原，將半抗原P1和A1與同一載體蛋白偶聯(lián)制備“多簇”免疫抗原，免疫動物獲得相應的多克隆抗體；采用高效液相色譜結合固相吸附的方法，測定了抗體與對硫磷、異丙威及其競爭原的吸附性能，并通過吸附動力學模型擬合抗體與化合物的吸附行為，獲得相應的吸附常數(shù)。結果表明抗體與小分子化合物的吸附動力學符合Freundilich模型，抗體與不同化合物的吸附常數(shù)為：對硫磷>P1>P4>P3>P2>P5，大小順序與ELISA親和常數(shù)的測定結果相符，與ELISA靈敏度測定結果有很好的相關性。

關鍵詞：液相色譜； 對硫磷； 異丙威； 競爭原； 抗體； 吸附常數(shù)

1引言

基于抗原抗體分子識別的免疫分析技術，特別是酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA）以特異、靈敏、簡便、快速的特點，在農藥殘留檢測中具有獨特優(yōu)勢[1]。半抗原、人工抗原、抗體及標記物是小分子免疫分析中的4個基本要素，抗體是核心試劑，而抗體的親和力（Affinity）是確定抗體性質的重要參數(shù)之一，是指抗體與抗原結合的緊密程度，多以親和常數(shù)（Affinity constant）表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非競爭ELISA法測定抗體的親和常數(shù)，該法不受抗原分子量大小的限制，操作簡便易行，結果可靠。但該方法只能測定抗體與包被抗原的親和力，而不能測定抗體與待測小分子化合物的親和力。

在競爭ELISA分析方法中，往往異源分析的靈敏度明顯高于同源分析[4]，即當抗體與待測化合物的親和力不變時，抗體與包被抗原的親和力越弱，待測化合物的競爭能力越強，方法靈敏度就越高。因此，抗體與包被抗原的親和力強弱不能指導方法建立中包被抗原的篩選，只能合成多種包被抗原后，通過免疫分析結果的評價篩選最佳的包被抗原[5]或利用分子模擬技術對抗體和半抗原進行模擬分析[6]，選擇合適的異源半抗原（競爭原）。而這些方法存在一定的盲目性或需要昂貴的設備和專業(yè)技術人員。因而，建立一種簡便、可靠的能直接比較抗體與競爭原和待測物親和力強弱的方法，可減少免疫分析中競爭原篩選的盲目性和工作量。

在ELISA測定中，抗體與競爭原的吸附屬于固液吸附，而固體液體界面的吸附過程可用Langmiur或Freundilich吸附動力學模型描述，獲得的吸附常數(shù)可用于表示主體和客體間的親和力大小[7]。有關利用吸附常數(shù)描述抗體與競爭原或待測物親和力大小的文章尚未見報道。本研究以抗對硫磷和異丙威抗體為例，采用高效液相色譜結合固相吸附的方法，測定“寬譜”抗體對對硫磷、異丙威及其半抗原的吸附能力，通過吸附常數(shù)的比較，判斷抗體的特性及競爭原的優(yōu)劣，并與ELISA分析結果相比較，驗證了方法的可行性。2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；iMARKTM酶標儀（美國BioRad公司）；DU 800核酸蛋白儀（美國Beckman公司）；Wellwash Plus洗板機（美國Thermo公司）；96孔聚乙烯酶標板（加拿大Jet Biochemical公司）；移液槍（美國Eppendorf 公司）。

對硫磷，異丙威標準品（國家標準物質研究中心）；牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二抗（羊抗兔）（SIGMA公司）；碳酸鹽緩沖液（CBS，0.05 mol/L，pH 9.6），磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.4）；PBST等緩沖液（實驗室配制）；甲醇（色譜純，美國天地公司）；其它試劑均為分析純。

2.2半抗原合成