副豬嗜血桿菌河南分離株的分離鑒定及藥敏試驗

董永軍，王麗榮，趙俊江

（1.河南科技學院動物科學學院，河南 新鄉 453003；2.河南科技學院抗體工程重點實驗室，河南 新鄉 453003）

副豬嗜血桿菌(HPS) 是一種多形態、非溶血性、不運動、NAD 依賴型、革蘭氏陰性細小桿菌，屬于巴斯德桿菌科嗜血桿菌屬。副豬嗜血桿菌只感染豬，有很強的宿主特異性，可以影響2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶后保育舍階段發病，感染高峰通常見于保育期的4～6周，發病率一般在10%～15%，嚴重時病死率可達50%[1]。副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的豬的一種以急性敗血癥、多發性漿膜炎和關節炎為特征的細菌性傳染病。該病為繼發性疾病，常在藍耳病病毒、圓環病毒等病毒感染后激發帶菌豬和慢性感染豬發病，成為本病的傳染源，病原菌主要存在于豬的上呼吸道，通過豬之間的接觸、空氣飛沫及污染物而傳播[2]。在集約化豬場中，當豬群遭受環境不良、轉群、去勢、免疫注射、飼養不當等應激因素影響， 或者豬群感染豬繁殖與呼吸綜合征等免疫抑制性疾病時， 副豬嗜血桿菌病伺機暴發， 造成嚴重的經濟損失[3]。目前， 該病已成為全球范圍內影響養豬業的典型細菌性疾病。

在特定的條件下引起豬的多發性漿膜炎和關節炎，主要臨床癥狀為發熱、食欲不振、厭食、反應遲鈍、咳嗽、呼吸困難、疼痛(尖叫)、關節腫脹、跛行、顫抖、共濟失調，可視黏膜發紺、側臥、消瘦和被毛凌亂隨之可能死亡。種豬急性感染后可能留下后遺癥，即母豬流產，公豬慢性跛行[4]。特征性病理變化為胸腔、腹腔漿膜及肺部炎癥，胸腔內有大量的淡紅液體及纖維素性滲出物。肺表面覆蓋有大量的纖維素性滲出物并與胸壁粘連，多數為間質性肺炎，部分有對稱性肉變。各臟器有不同程度的出血、淤血和壞死。鏡檢滲出物中有大量纖維蛋白、中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞和單核細胞。實質細胞呈現不同程度的顆粒變性、水泡變性和壞死，實質和間質可見充血、出血、炎性細胞浸潤、纖維性滲出和水腫液蓄積[5]。

近年來，副豬嗜血桿菌病在國內豬場引起多發性漿膜炎和關節炎的報道屢見不鮮，其發病率和死亡率日漸升高。為此，本實驗對河南省內疑似病例進行病原分離培養，以對本病藥物防控中藥敏檢測及其滅活菌苗研制奠定基礎；本實驗還采用病原學和生化鑒定診斷， 并進行藥敏試驗， 以期為該病的診治提供臨床依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集

對河南某豬場的15頭疑似副豬嗜血桿菌感染的病仔豬進行病理剖檢。無菌條件下抽取心血、心包液和腹水，并采集病變明顯的肺、心、腎臟等病料進行病原學檢查。

1.1.2 菌種與主要培養基

金黃色葡萄球菌，各種藥敏試紙片（左旋氧氟沙星、恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶、乳酸環丙沙星、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、克林霉素、硫酸慶大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、鹽酸林可霉素、氨芐西林、青霉素鉀等）；煙酰胺嘌呤二核苷酸、美蘭染色、革蘭氏染色、HE染色試劑，普通營養瓊脂平板、麥康凱培養基、綿羊鮮血瓊脂平板、加NAD的巧克力瓊脂平板和TSA培養基、TSB 液體培養基均自制。

1.1.3 生化鑒定微量發酵管及試劑

葡萄糖發酵管、蔗糖發酵管、甘露糖發酵管、木糖發酵管、棉籽糖發酵管、甘露醇發酵管、硫化氫微量發酵管，氧化酶、3%過氧化氫、硝酸鹽培養基。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養

無菌操作條件下， 采集病豬的心血、心包液、腹水、肺、心、腎臟等病料，首先劃線接種于含NAD的巧克力瓊脂平板或TSA培養基上，37 ℃培養48 h，然后挑取單個菌落進一步純化培養[6]。

1.2.2 染色鏡檢

將培養后的單個疑似菌落涂片， 進行美蘭染色和革蘭氏染色， 鏡檢，觀察菌體形態及染色特性。

1.2.3 培養特性

取疑似副豬嗜血桿菌菌落分別接種于普通營養瓊脂平板、麥康凱培養基、綿羊鮮血瓊脂平板、含NAD巧克力瓊脂平板和TSA培養基，37 ℃恒溫培養48 h， 觀察菌落的生長情況。

1.2.4 生化鑒定

糖類分解試驗：取純培養后的細菌分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖發酵管內，倒置于潔凈的小燒杯內，置滅菌培養皿中。37 ℃培養24 h，觀察并記錄結果。結果判斷：無變化，培養液仍為紫色，陰性反應；產酸，培養液為黃色及產酸又產氣，培養液變黃，并有氣泡，陽性反應。

硫化氫試驗：取純培養的細菌接種于硫化氫微量發酵管，置于37 ℃培養24 h 后觀察，培養液黑色者為陽性，無色者為陰性[7]。

氧化酶試驗：加2～3滴試劑于濾紙上，用牙簽挑取1個菌落到紙上涂布， 觀察菌落反應。陽性反應在5～10 s內由粉色到黑色，15 min后可出現假陽性反應。也可以將試劑滴在細菌的菌落上，菌落成玫瑰紅然后到深紫色者為陽性。

觸酶試驗：可用接種環將菌落放于載玻片的中央，加1滴3%過氧化氫于菌落上，立即觀察有無氣泡出現；也可以直接將3%過氧化氫滴加到菌落上觀察有無氣泡出現。

硝酸鹽還原試驗：把純菌接種到硝酸鹽培養基中，在37 ℃培養18～24 h，再加試劑甲（對氨基苯磺酸0.8 g+5 mol/L醋酸100 mL）和乙（α-奈胺0.5g + 5mol/L醋酸100 mL）各3～5滴，在30 s內出現紅色即為陽性。若無顏色出現，加少量鋅渣，隨后出現紅色則是真正的陰性試驗。[8]

1.2.5 衛星現象觀察

挑取經純化培養的可疑菌落，于綿羊鮮血瓊脂平板上水平畫線，再挑取金黃色葡萄球菌垂直劃線，37 ℃培養24～48 h， 觀察是否有衛星生長現象。

1.2.6 動物試驗

將純化菌接種于TSB 液體培養基，18 h后經菌落計數，將培養液稀釋成每毫升含2×105個菌，皮下注射0.2 mL稀釋液于小白鼠。

1.2.7 藥敏試驗

將培養純化的菌種均勻涂布于含NAD的巧克力培養基上，然后按常規紙片法，將各種藥敏試紙片（左旋氧氟沙星、恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶、乳酸環丙沙星、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、克林霉素、硫酸慶大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、鹽酸林可霉素、氨芐西林、青霉素鉀等）貼于平板上，37 ℃恒溫培養18～24 h，觀察抑菌圈大小。

判定標準： 抑菌圈直徑大于15 mm 為高度敏感；抑菌圈直徑在10～15 mm之間為中度敏感；抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥[9]。

2 結果與分析

2.1 分離培養結果

分離到3株細菌，分別命名為HPS 1、HPS 2、HPS 3。

表1 藥敏實驗結果

2.2 染色鏡檢

革蘭氏染色陰性，多呈短桿狀，有的呈球桿狀，出現急性敗血癥的病豬血涂片美蘭染色可見大量細菌，符合副豬嗜血桿菌的菌落和細菌形態[10]。

2.3 培養特性觀察

3株細菌在普通瓊脂平板、麥康凱培養基、鮮血培養基上均不生長，在含NAD巧克力培養基和TSA培養基上呈光滑、無色透明或灰白色半透明、露珠狀、扁平的小菌落。

2.4 生化鑒定結果

3個菌株均發酵蔗糖、甘露糖和葡萄糖，但不發酵甘露醇和木糖，棉籽糖不穩定(HPS 1為陽性，其余為陰性)，硫化氫試驗呈陰性，氧化酶試驗呈陰性，觸酶試驗呈陽性，硝酸鹽試驗呈陽性。所分離細菌鑒定結果均符合副豬嗜血桿菌的生化特性[11]。

2.5 衛星現象觀察

在金黃色葡萄球菌線兩側有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長，呈現出典型的“衛星現象”并且不出現溶血現象，證明此菌為依賴NAD生長的細菌。

2.6 動物試驗結果

56 h后小白鼠出現毛松、呆滯等癥狀。68 h后小白鼠出現死亡。從死亡的小白鼠回收到原病原菌。

2.7 藥敏試驗結果

從表1可以看出，分離菌株對左旋氧氟沙星均高敏，對恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉全部敏感，對替米考星、阿莫西林、鹽酸林可霉素、氨芐西林、青霉素鉀均不敏感或耐藥，對乳酸環丙沙星、克林霉素、硫酸慶大霉素、氟哌酸等藥物敏感性表現不一。

3 討論

副豬嗜血桿菌曾被認為是一種隨機入侵的次要病原，在與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌等協同作用時才引發臨床癥狀[12]。目前在獸醫臨床上副豬嗜血桿菌病已經變成一種常見的、可獨立發生的疾病。本試驗在分離病原時，對發熱期病豬采集耳緣靜脈或前腔靜脈的血液； 病豬死后，采集心血、心包液、胸水、腹水、纖維蛋白性滲出物、肺臟和肝臟等作為病料，在患豬剖殺或死亡后12 h以內進行病原分離，可提高副豬嗜血桿菌的分離率。

細菌培養通過直接利用磷酸化NAD提供V因子，解決了配制培養基的問題。所分離細菌菌落較大，呈圓形灰白而突起，為革蘭氏染色陰性，短桿狀或球桿狀，細菌形態與報道的相一致，疑似菌株生化實驗結果表明，不溶血，可發酵蔗糖、甘露糖和葡萄糖，但不發酵甘露醇和木糖，硫化氫試驗陰性，氧化酶試驗陰性，觸酶試驗陽性，硝酸鹽試驗陽性，均符合副豬嗜血桿菌的培養特性。

從藥敏試驗結果可以看出，分離菌對氟喹諾酮類藥物和頭孢噻呋鈉高度或中度敏感，有試驗報道認為副豬嗜血桿菌對頭孢唑啉高度敏感，對頭孢哌酮、氟苯尼考敏感，而對復方新諾明、青霉素G等有耐藥性。原因可能是由于氟喹諾酮味苦而對豬群不常采用；左旋氧氟沙星和頭孢噻呋鈉的平均抑菌圈直徑分別為22.0 mm和13.3 mm，說明左旋氧氟沙星在被調查豬場應用較少，保持高度敏感，頭孢噻呋鈉已有應用，抗菌作用不理想；氨基糖苷類抗生素在臨床上大量應用，通常以注射給藥為主，所以呈現部分為中度敏感；普遍應用的青霉素、氨芐西林、阿莫西林和林可霉素等已不敏感。如果豬場經常使用某種抗生素，對母豬進行定期群體預防性混飼給藥，其攜帶耐藥基因的細菌會通過哺乳、與子代共同生活等而傳遞給下一代，使耐藥性變得嚴重。也有學者進行中藥藥敏試驗，結果表明金銀花及其復方制劑對副豬嗜血桿菌抑制作用明顯。因此在臨床上，應避免盲目用藥現象，特別是在進行群體治療時，最好先進行藥敏試驗，針對性地選擇高敏藥物，在發病早期采用全群注射給藥法，或者采用部分中藥制劑進行輔助治療，以便達到最佳治療效果。

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的常在寄生菌，是很難控制與凈化的一種呼吸道感染病原。在環境衛生不好的豬場或者有其他發病感染時通常容易誘發副豬嗜血桿菌病的暴發。要想控制住疫情的暴發，豬場應該積極采取各種綜合防控措施：首先應該改善飼養管理，補充飼料的各種營養成分，同時加強其他疾病的防控，自身也應該做好疫苗注射，增強仔豬對副豬嗜血桿菌的免疫力；其次，制訂一套嚴格的管理制度，對外來的人員或外地購進的仔豬應該進行嚴格的檢疫后才可進入養殖場；第三，對于養殖場自身環境進行改良，注意殺菌滅菌，防止豬的感染。

總之，副豬嗜血桿菌病的防治，應采取“養防結合”，有實力的養殖場應做藥敏試驗，選擇敏感藥物以便快速經濟地控制副豬嗜血桿菌病的發生。預防中加強飼養管理，以減少或消除其他呼吸道病原，如提前斷奶，減少豬群流動，杜絕豬生產各階段的混養狀況等。

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