強力接骨膠囊在骨折愈合早中期對BMP表達影響的應用基礎研究?

李勇強，曹永登，侯 宇，李 霞，李曉燕，邵雅華，黃 葳，張 麗，師青春，滕義和

(黑龍江省中醫藥科學院，哈爾濱 150001)

骨挫傷和骨折是骨傷科臨床的常見病、多發病，如何促進骨折愈合特別是骨質疏松患者的骨質愈合一直是骨科研究的熱點問題。現代醫學多從基因水平揭示骨折愈合的作用機制，BMPs影響骨折愈合是目前現代醫學研究的重要內容。強力接骨膠囊具有活血化瘀、補益肝腎、接骨續筋的功效，在我院已有20多年臨床應用，具有副作用少、療效確切、經濟簡便的獨特優勢，而強力接骨膠囊如何促進骨折愈合的現代研究尚屬空白。筆者擬從分子生物學水平、以骨折端骨形態發生蛋白-2(BMP-2)含量的變化作為主要研究內容，對強力接骨膠囊在骨折愈合早中期BMP-2表達的影響進行了探討，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料

健康成年新西蘭長耳大白兔90只，雌雄各半，平均兔齡8.4個月，平均體質量2.3 kg，由黑龍江省中醫藥科學院實驗動物中心統一提供；強力接骨膠囊，由本院(省級三甲醫院)制劑室按國家藥品標準制成口服膠囊制劑；骨折挫傷膠囊，由哈高科佳木斯中藥有限公司生產；1%BMP第一抗體細胞抗BMP單克隆抗體工作溶液，由第四軍醫大學口腔醫院病理科提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 把90只兔隨機分為用藥組、對照組、空白組，分組后用咬骨鉗在橈骨中下1/3處造成0.4 cm骨缺損的骨折模型，用手術縫合線仔細逐層縫合肌肉、皮下組織、皮膚，并用無菌紗布包扎，不做任何固定。

1.2.2 給藥方法 造模后第2天開始用藥組以0.5 g/(kg·d)標準喂服強力接骨膠囊，對照組以0.3 g/(kg·d)標準喂服骨折挫傷膠囊，空白組喂以白開水。所有實驗動物由專門技術人員在同一實驗條件下統一喂養和管理。

1.3 標本取材

將3組分別于骨折后用藥1～5周后，從各組中分別隨機抽出6只大白兔，通過耳緣靜脈推入40 ml空氣，利用靜脈空氣栓塞法使其致死。以骨折端為中心取出4.0 cm骨質，剔除骨質上軟組織及皮膚，保留骨折端上的骨痂，作為實驗用標本。

1.4 組織學標本制備

實驗標本用4﹪多聚甲醛溶液浸泡固定，再用EDTA進行脫鈣，最后用石蠟包埋并切片。每組切片中隔3張抽1張進行蘇木紫-伊紅(HE)染色并進行組織學觀察，余下切片進行免疫組化BMP-2染色。

1.5 免疫組化檢測

按照BMP-2免疫組化試劑盒操作方法，對切片進行免疫組化染色。切片染色后，通過與計算機相連的顯微鏡，在顯微鏡放大400倍的情況下將采集到的免疫組化切片圖像存入計算機，并用病理圖像分析系統對其進行分析。然后采用彩色分割方法，分割免疫組化切片圖像中BMP-2陽性產物區域，從而求出陽性產物平均光密度值和陽性平均積分光密度。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 HE染色觀察

術后1周，用藥組在骨折斷端可見大量骨痂生成，骨痂局部可見大量的成纖維細胞、成骨細胞和軟骨細胞，以成纖維細胞為主且分化較成熟，并有少量骨小梁的形成。對照組骨折斷端可見較多成纖維細胞和軟骨細胞，但幼稚細胞多見。空白組骨折斷端成纖維細胞、軟骨細胞數量最少且排列稀疏。空白、對照組均未見骨小梁的形成。

術后2周，用藥組骨折斷端可見較多的骨小梁形成，并有大量的軟骨細胞、成骨細胞，且軟骨細胞大多分化成熟，成骨細胞較大，成纖維細胞數量較1周前減少。對照組可見大量的成纖維細胞，成骨細胞、軟骨細胞相對較少，且分化較成熟。空白組成纖維細胞較多，分化較成熟的成骨細胞、軟骨細胞少見。空白組、對照組可見骨小梁形成但排列稀疏。

術后3周，用藥組骨小梁進一步增多，排列整齊致密的成骨細胞、骨細胞多見，同時出現少量破骨細胞。對照組成骨細胞數量增多，成纖維細胞減少；空白組成纖維細胞增多。

術后4周，用藥組可見大量成熟的骨細胞，并有板層骨、破骨細胞增多。對照組可見較多成骨細胞，并可見少量骨細胞。空白組成纖維細胞減少，可見成骨細胞，少量骨細胞。

術后5周，用藥組可見大量骨小梁形成，骨細胞排列致密整齊且大都形成橋接，并可見致密性骨皮質。對照組可見大量成骨細胞、較多骨細胞、骨小梁增多，大部分未形成橋接，致密性骨皮質少見。空白組成骨細胞增多，未見橋接形成。

2.2 免疫組化染色觀察

術后1周，用藥組出現大量的纖維性骨痂，骨痂中有較多的BMP-2強陽性染色細胞。對照組可見少量纖維性骨痂，空白組未見明顯的纖維性骨痂。成纖維細胞中對照組BMP-2呈弱陽性表達，空白組未見明顯染色。

術后2周，用藥組的成骨細胞、細胞外基質、間充質細胞染色明顯增強，BMP-2陽性表達程度強。對照組成骨細胞、間充質細胞呈陽性表達，但染色明顯淺于用藥組。空白組亦可見BMP-2陽性細胞表達，但在數量、著色方面較用藥組更少。

術后3周，用藥組的BMP-2的陽性表達減弱，對照組、空白組陽性表達已增強，但三組比較，在表達上用藥組最強，對照組次之，空白組最弱。

術后4周，用藥組陽性細胞表達的數量、范圍減少，且成熟的軟骨細胞未見明顯的陽性染色，成熟骨細胞染色淺。對照組、空白組陽性細胞表達增多，范圍加大，但著色較用藥組淺。

術后5周，用藥組陽性細胞表達數量、范圍進一步減少，成熟骨細胞未見明顯染色。對照組、空白組陽性細胞表達范圍較前增多，軟骨細胞、骨細胞可有較淺的染色。

所有切片中骨痂局部BMP-2含量最高，成熟骨細胞未見明顯的陽性染色。縱向比較，3組術后陽性表達細胞BMP-2呈“少→多→少”的含量變化，但用藥組染色高峰出現在術后2周，對照組、空白組染色高峰相對延后，空白組出現最晚。橫向比較，用藥組陽性染色最強，對照組次之，空白組最弱，術后第1、2周最為明顯。陽性產物平均光密度值和陽性產物平均積分光密度見表1、2。

表1 不同觀察時間骨痂中BMP-2表達光密度均值

注：用藥組與空白組、對照組比較：*P<0.05

表2 不同觀察時間骨痂中BMP-2表達平均積分光密度

注：用藥組與空白組、對照組比較：*P<0.05

3 討論

骨折的愈合是機體損傷后復雜的組織學和生物化學變化過程，需要許多不同的細胞、生長因子參與修復，其中BMP-2在骨折愈合過程中起重要作用。其通過調節、誘導骨組織，使組織中未分化的間充質細胞遷徙、增殖、分化，從而調節及誘導成骨細胞、成軟骨細胞的生長，促進骨、軟骨組織形態形成，分化成為骨細胞、軟骨細胞。侯曉峰等[1]在鹿茸對實驗型骨折愈合中BMP-2表達影響的研究中，發現BMP能刺激間充質細胞的分化，對干性成骨細胞及誘導性成骨母細胞，BMP能刺激其分化成為軟骨細胞及骨細胞，從而形成軟骨及骨組織。畢鍇、溫建民等[2]在中醫骨折三期治療對家兔骨折愈合中VEGF與BMP-2表達影響的實驗研究中，通過對家兔骨折愈合過程中BMP-2的免疫組化檢查的圖像分析，發現中醫藥在治療骨折中能顯著促進骨折愈合中BMP-2的表達。周成洪等[3]在探究接骨3號方對

兔撓骨骨折術后BMP-2表達影響的研究中發現，接骨3號方在骨折愈合過程中對BMP-2的持續表達有明顯的促進作用。BMP-2有很強的促進成骨細胞分化和誘導體外成骨的能力，且已在體內和體外的實驗中得到證實[4]。吳劍靜等[5]在仙鹿健骨湯含藥血清對成骨細胞礦化結節及BMP-2表達影響的實驗研究發現，仙鹿健骨湯含藥血清不僅能促進體外培養的新生SD大鼠成骨細胞礦化功能，促進礦化結節的形成，還能提高新生SD大鼠成骨細胞中BMP-2的表達水平，增加骨細胞的形成。多數學者認為，中藥可以促進骨折部位骨基質鈣鹽沉積，提高骨痂質量，促進生長激素分泌，可以提高BMP的含量，促進成骨細胞分泌TGF-β，對IGF-1的產生有促進作用[6～8]。

在本次實驗中，術后1周屬于纖維骨痂階段，成纖維細胞增生活躍。用藥組在術后1周纖維骨痂大量增生，多于對照組，遠多于空白組，局部骨痂BMP-2的陽性表達均強于對照組和空白組。術后2～3周，骨折的愈合逐漸由纖維骨痂階段進入軟骨成骨階段。此時間充質細胞大量增殖、分化為成骨細胞，成骨細胞功能異常活躍，BMP-2的含量最多、表達最強。用藥組BMP-2出現高峰在2周，比對照組提前1周出現，同時BMP-2表達的強度也明顯強于對照組和空白組。術后4～5周，骨折愈合開始轉入骨痂的修復與塑型階段。成骨細胞逐漸減少，骨小梁、板層骨不斷構建完成，同時在塑型期破骨細胞不斷增多，而由于成熟骨細胞的不斷增多，陽性細胞數量的表達不斷減少，著色較淺。從整個實驗過程中可以看出，用藥組的BMP-2陽性表達程度上較對照組、空白組強，數量較對照組和空白組多，峰值出現的時間較對照組、空白組早。由此可推測，強力接骨膠囊對BMP-2的合成、分泌有促進作用，并影響其分布和改變其表達時間與表達量，從而起到促進骨折愈合的作用。

中醫藥治療骨折依據整體觀念把“瘀去、新生、骨和”作為理論，把握骨折各期的不同病理特點，結合骨折各期治則，運用中醫藥理論治療各期病人。強力接骨膠囊根據以上理論研制而成，經過多年的臨床實踐探索，方選當歸、紅花、續斷等23味中藥，意在活血化瘀、接骨續筋、補益肝腎、調理氣血。強力接骨膠囊在臨床應用上已有20多年的臨床應用基礎，療效頗多。但從未在分子生物學水平上闡述其機理。本實驗研究采用對BMP-2的表達影響做一定的探索，從分子生物學水平闡述其對骨折的影響，但骨折愈合是十分復雜的過程，強力接骨膠囊對BMP-2表達的影響和確切機理還有待進一步研究。

[1] 侯曉峰，李朝旭，劉景生.鹿茸對實驗型骨折愈合中BMP-2表達的影響[J].遼寧中醫雜志，2005, 32 (4): 374-376.

[2] 畢鍇，溫建民，孫永生，等.中醫骨折三期治療對家兔骨折愈合中VEGF與BMP-2表達影響的實驗研究[J].中國中醫基礎醫學雜志，2012,12(18):1344-1347.

[3] 周成洪，龍亨國，詹旭.接骨3號方對兔撓骨骨折術后BMP-2表達的影響[J].中華中醫藥學刊,2012,30(6):1262-1267.

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[5] 吳劍靜，康孟樂，王靖，等.仙鹿健骨湯含藥血清對成骨細胞礦化結節及BMP-2表達影響的實驗研究[J].浙江中醫雜志，2010，45(2)：103-105.

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