扶正解毒方對前胃癌荷瘤小鼠術后復發模型腫瘤相關巨噬細胞及相關細胞因子的干預研究?

賈程輝，李枋霏，何莉莎，李 杰△

(1.中國中醫科學院廣安門醫院腫瘤科,北京 100053； 2.北京中醫藥大學，北京 100029)

近年來，人們認識到腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAM)并非發揮抗腫瘤作用，而是參與并促進腫瘤發生、侵襲和轉移的過程[1～3]。目前認為，巨噬細胞至少包括2種不同的活化表型和功能特征亞群[4]：①經典活化的巨噬細胞(classically activated macrophages，caMphi) M1型；②替代性活化的巨噬細胞(alternatively activated macrophages，aaMphi) M2型。Mantovani等[5]認為，M1型和M2型巨噬細胞是巨噬細胞連續活化狀態的兩個極端，并指出TAM可能發生替代性活化，更偏向于M2型極化的巨噬細胞，遞呈抗原的能力很弱，能抑制T細胞增殖，參與腫瘤的生長、進展和轉移，以及適應性免疫、血管生成和間質形成等過程[6]。CD分子是確定淋巴細胞表型和分離純化淋巴細胞的重要依據。已有文獻報道[7]，M2型巨噬細胞表面甘露糖受體(CD206)表達明顯上調，而M1型巨噬細胞FcγⅢ/Ⅱ受體CD16/32表達增加，兩者是判斷巨噬細胞類型的重要表面標志，其中誘導巨噬細胞向M2型分化的因子包括IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β1。本實驗在原有實驗基礎上進一步觀察扶正解毒中藥抑制腫瘤復發、轉移的機制，并推測可能通過抑制腫瘤相關巨噬細胞因子的表達，改善腫瘤微環境，促使M2型巨噬細胞向M1型轉化，進而影響腫瘤的轉移和復發。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級近交系6～7周615小鼠，雌雄各半，體質量18～20 g，購自中國醫學科學院藥品鑒定所實驗動物中心。

1.1.2 瘤株 小鼠前胃癌細胞由中國醫學科學院基礎醫學研究所病理室用甲基卞基亞硝胺灌胃誘發而成,移植率100%。

1.1.3 藥物 實驗用扶正解毒方為深棕色浸膏，每1 g浸膏含生藥6 g，由黃芪、黨參、生白術、枸杞子、土茯苓、制何首烏、藤梨根組成制劑由中國中醫科學院廣安門醫院制劑室提供。陽性對照化療藥物為5-氟脲嘧啶注射液10 ml/支、0.25 g/支,由上海旭東海普藥業有限公司生產。

1.1.4 試劑 Mouse IL-4、 IL-10 、IL-13 、TGF-β Immunoassay ELISA Kit (R&D,USA)；PE anti-mouse F4/80 ，PE Rat IgG2a,κ Isottype Ctrl (Biolegend,USA)；APC anti-mouse CD206 ，APC Rat IgG2a, κ Isottype Ctrl (Biolegend,USA)；FITC anti-mouse F4/80，FITC Rat IgG2a, κ Isottype Ctrl (Biolegend,USA)。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 復蘇小鼠前胃癌細胞(MFC)，傳代培養3代，對數生長期時胰酶消化終止生長，制備成單細胞懸液，調整細胞濃度為4×107/ml，取0.05 ml瘤細胞懸液接種于小鼠左側后肢爪墊內側皮下(移植時避免細胞懸液外溢)。

1.2.2 給藥方法 足墊接種MFC細胞后14 d切除原發瘤，依據原發瘤重隨機分組。對照組為不接瘤的正常小鼠及不接瘤但實行截肢手術小鼠，其他組為接瘤組。①對照組(Normal-operation、Normal)：自截肢后24 h給予小鼠飲水灌胃，每日0.2 ml，每日1次；中藥組(FZJD-treated)：自截肢后24 h給予小鼠扶正解毒中藥灌胃，每日0.2 ml，每日1次。每公斤體質量小鼠用藥量相當于成人(按60 kg計)臨床用量的15倍；化療組(5-FU- treated)：從截肢后當日給予5-氟脲嘧啶注射液，按照20 mg/kg 劑量腹腔注射 0.2 ml，每天1次，連續 7 d；②中西醫結合組(FZJD+5-FU)：自截肢后24 h給予小鼠扶正解毒中藥灌胃，每日1次0.2 ml。每公斤體質量小鼠用藥量相當于成人(按60 kg計)臨床用量的15倍。并給予5-氟脲嘧啶注射液，按照20 mg/kg 劑量腹腔注射 0.2 ml，每天1次，連續7 d；模型組(untreated)：自截肢后24 h給予小鼠飲水灌胃，每日1次0.2 ml。15 d后處死小鼠，取血、復發瘤和脾臟組織。

1.3 檢測

1.3.1 流式細胞術檢測M1、M2型巨噬細胞表型 將復發瘤、脾臟從小鼠身上剝離，PBS沖洗干凈，稱取組織1 g分別置于培養皿中(預冷)，用無菌眼科剪剪成小塊置濾膜中研磨。吸取所有研磨液濾至新離心管中，1200 rpm離心5 min，倒走上層清液；2%FBS-PBS1200 rpm離心洗滌3次，每次5 min；將細胞重懸在2%FBS-PBS，即為腫瘤組織的單細胞懸液，0.4%臺酚藍染色，顯微鏡下進行細胞計數，顯示細胞存活率大于90%；取1×106個細胞重懸于100 μl 2%FBS-PBS中，用微量移液槍滴加PE-F4/80+和APC-CD206+、FITC-CD16/32抗體各2 μl，避光孵育20 min；PBS洗滌2遍，將細胞重懸于300 μl 1%多聚甲醛中過濾，上流式細胞儀檢測。

1.3.2 ELISA法檢測IL-4、IL-10、IL-13 、TGF-β1的含量 制取小鼠血清分裝樣本儲存于-80℃冰箱中，檢測前置于室溫融化。每個微孔中加入50 μl Assay Dilute RD液，再分別加入50 μl標準檢測樣本、對照樣本、小鼠血清樣本，輕輕拍打微板框1 min充分混勻，蓋上黏條室溫孵育2 h。吸走微孔中的液體，加入400 μl的wash buffer洗滌5次，將微孔板翻轉在厚紙巾上拍打直至吸干所有液體。在每個微孔中加入100 μl抗體結合物Conjugate，蓋上黏條，室溫孵育2 h；重復洗滌步驟，在每個微孔中加入100 μl顯色反應液Substrate Solution，室溫避光孵育30 min，在每個微孔中加入100 μl反應終止液Stop solution，輕輕拍打微板以混勻，將微板置于酶標儀，在450 nm與570 nm波長下檢測吸光度OD值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 扶正解毒中藥對脾臟組織中M2、M1型巨噬細胞表達含量的影響(表1)

2.2 扶正解毒中藥對腫瘤組織中M2、M1型巨噬細胞表達含量的影響(表2)

2.3 扶正解毒中藥對不同組織不同干預模式下M2/M1比值的影響(表3)

2.4 前胃癌小鼠血清中腫瘤相關細胞因子的表達 (表4)

3 討論

國家“八五”期間，我科采用扶正解毒方劑配合化療治療胃腸癌術后277例。臨床研究表明，該藥不但能增加化療完成率，Ⅲ期胃癌5年生存率比健脾益腎沖劑同期胃癌5 年生存率還提高了9.1% ，生存期得到一定延長[8]。前期動物實驗結果顯示，扶正解毒方聯合5-FU抑制局部腫瘤復發率達75%，抑制遠處肺轉移率達50.07%，抑制淋巴結轉移率達75.80%，提高生存期率達16.91%，與臨床研究結果相符，且同單一治療方案比較具有明顯優勢。

表1 脾臟組織中M2、M1型巨噬細胞含量

注：中西醫結合組與模型組、化療組、中藥組比較：#P<0.05；與正常空白組、空白術后組比較：P>0.05； 模型組與其他各組比較：*P<0.05

表2 腫瘤組織中M2、M1型巨噬細胞含量比較

注：中西醫結合組與模型組比較：#P=0.036<0.05；與中藥組、化療組比較：P>0.1；模型組與其他各組比較：*P=0.034<0.05

表3 不同組間M2/M1比值情況變化表

注：模型組與其他各組比較：*P=0.000<0.05)； 中西醫結合組與中藥組、化療組比較：#P<0.05； 模型組與其他各組比較**P=0.000<0.05；中西醫結合組與中藥組、化療組比較：&P<0.05

表4 小鼠血清中腫瘤相關細胞因子表達表

注：中西醫結合組與模型組比較：#P=0.013<0.05； 模型組與其他各組比較：*P<0.05；模型組與其他各組比較：**P<0.05；中西醫結合組與模型組、中藥組、化療組比較：&P<0.05

腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAM)是腫瘤間質的主要組成部分，約占腫瘤間質中炎癥細胞的30%～50%。Porta等[9]在總結前人TAM研究成果的基礎上，提出巨噬細胞具有殺傷腫瘤和促瘤生長的雙重作用。M1型巨噬細胞可通過直接或間接分泌多種促炎性細胞因子殺傷病原體和腫瘤細胞；而M2型巨噬細胞表現為較低的抗原提呈能力，并可通過分泌抑制性細胞因子如IL-10、TGF-β等下調免疫應答。IL-4 、IL-10、IL-13 和 TGF-β都是與 M2 型巨噬細胞有著密切關系的細胞因子。腫瘤組織可釋放這些細胞因子使血液中的單核細胞募集并分化為 TAM，而 TAM 本身也可分泌這些因子從而促進腫瘤的生長。如此形成一個惡性循環，使得 TAM 浸潤程度加深，腫瘤惡性進程加快。

從實驗結果可推測，M2型巨噬細胞和腫瘤的發生發展有相關性且關系密切。 實驗結果，接瘤組和非接瘤組M2型巨噬細胞表達含量明顯高于非接瘤組；不同組織中，表達含量差異明顯，脾臟中M1型含量大于M2型，而腫瘤組織中與之相反；不同的干預模式下，模型組(只接瘤不藥物干預)M2型巨噬細胞的含量明顯高于其他組，M1型巨噬細胞含量低于其他組，給予扶正解毒中藥、5-FU、中西結合治療后M2、M1變化明顯。

M2/M1比值對于胃癌的預后評估有一定的參考意義， 實驗結果可知，脾臟組織中兩者比值呈“斜坡形”下降，腫瘤組織中者的比值呈“峭壁形”下降。無論是腫瘤組織、脾臟組織中M2/M1，模型組均高出其他組若干倍，與其他組比較差異有統計學意義(P<0.01)。給予扶正解毒中藥、化療藥、中西結合治療后，數值下降趨勢非常明顯。相較于單一細胞值來講，二者比值更為靈敏，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)，IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β1助長了腫瘤的發生、進展。實驗模型組高表達M2 型巨噬細胞相關細胞因子，腫瘤可引起4種因子的高表達；單純使用扶正解毒中藥干預后，4種因子含量有所降低，IL-3、TGF-β1的含量甚至比化療組更低，中西結合組下降更明顯；不同組別細胞因子的表達趨勢同腫瘤相關巨噬細胞表達一致，從側面證明腫瘤相關巨噬細胞同腫瘤發生發展的相關性。

總之，扶正解毒方在一定程度上促使M2型巨噬細胞向M1型轉化，抑制M2 型巨噬細胞相關細胞因子的分泌，從而抑制腫瘤生長和血管、淋巴管生成，一定程度上降低了腫瘤侵襲和轉移力，而中西藥的聯合能有效抑制腫瘤的復發轉移。

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